Induceret Pluripotente Stem Cell Generation fra Blood Cells Brug Sendai Virus og Centrifugering
Summary
We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.
Abstract
Den seneste udvikling af menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) viste, at modne somatiske celler kan vende tilbage til en udifferentieret, pluripotent tilstand. Nu er omprogrammering gjort med forskellige typer af voksne somatiske celler: keratinocytter, urin, fibroblaster osv Tidlige eksperimenter blev normalt gøres med dermale fibroblaster. Men dette krævede en invasiv kirurgisk procedure for at opnå fibroblaster fra patienterne. Derfor suspensionsceller, såsom blod og urin celler, blev anset ideel til omprogrammering grund af bekvemmelighed for at opnå de primære celler. Her rapporterer vi en effektiv protokol for iPSC generation fra mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er). Ved udpladning de transducerede PBMC'er serielt til en ny, matrix-coatede plade ved hjælp af centrifugering, kan denne protokol nemt give IPSC kolonier. Denne metode er også for navlestrengen mononukleære navlestrengsblod celler (CBMCs). Denne undersøgelse præsenterer en enkel og effektiv protocol til omprogrammering af PBMC'er og CBMCs.
Introduction
Stamceller har været en af de mest attraktive materialer i klinisk terapi i de sidste mange årtier 1. De attraktive egenskaber af stamceller er pluripotens og evnen til at forny sig selv. I 1981 blev de første embryonale stamceller (EKSF) isoleret fra museembryo 2. Men når teknikken blev anvendt på menneskelige embryoner, det står over for en række etiske spørgsmål.
I 2006, da Dr. Yamanaka og hans team omprogrammeret den første pluripotente celle fra muse somatiske celler, stamceller felt genvundet sin mulighed og interesse blev rekindled 3. Ved at levere flere definerede faktorer, pluripotente stamceller var succesfuldt "fremkaldt" fra voksne somatiske celler, og blev derfor kaldt "inducerede pluripotente stamceller (iPSCs)." I 2007 blev denne teknik anvendes på humane celler 4, hvilket giver celler med de nøjagtige karakteristika økonomiske og sociale råd, men ingen af den etiske debat. Teoretisk iPSCs kan genereres fra enhver celletype opnået fra et individ eller en patient. Patientspecifikke iPSCs stiger som en potentiel værktøj, der kan simulere sygdomsfænotyper og epigenetiske betingelser for den enkelte patient. Brug af genet redigering eller andre metoder, der kan vende den patogene tilstand, kan patient-specifikke iPSCs også anvendes i personaliseret medicin 5. Desuden er iPSCs mindre forbundet med immun afstødning fordi de har samme immun identitet som donor, hvilket gør auto-transplantation mere gennemførlig 6. Derfor har iPSCs blevet den mest lovende platform i sygdom modellering, narkotika screening, og regenererende behandlinger. På baggrund af disse fordele, forbedrede protokoller, der kan give renere og højere udbytter i det mindste beløb af tid fra den mindste celle kilde er konstant under udvikling. En væsentlig overvejelse om at finde den mest effektive protokol til fremtidig anvendelse er den primære celletype. De fleste af de tidlige iPSC generation protocols er optimeret til adhærente celler, da de oprindelige IPSC linjer blev induceret fra hudfibroblaster 4. Men isoleringen og fremstillingen af disse celler er arbejdskrævende. Også, isolering af huden fibroblaster omfatter invasive kirurgiske procedurer, der kan blive en stor mangel for bredere anvendelse.
Derfor til den videre anvendelse af iPSCs, en celle kilde med praktisk erhvervelse er påkrævet. Blod betragtes som en ideel cellekilde, da det opnås ved en temmelig minimalt invasiv procedure 7-9. I denne undersøgelse har vi udviklet en simpel modifikation til protokollen generere hiPSCs fra mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er). Uden den vanskelige ekspansionsprocessen af en specifik celletype, såsom CD34 + celler, blev hele blodlegemer eller PBMC'er serielt udpladet på matrix-coatede plader ved centrifugering efter transduktion med Sendai-virus indeholdende Yamanaka faktorer. Denne fremgangsmåde reducerede den tid der kræves tilfastgørelse af transducerede flydende celler og faldt tabet af omprogrammerede celler, som ikke var i stand til at vedhæfte på egen hånd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da embryonale stamceller (EKSF) viste flere mangler, blev behovet for et alternativt værktøj påkrævet. Derfor er udviklingen af inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) ved Yamanaka kom under det internationale søgelys. Det har været næsten et årti siden Yamanaka opdagede at pluripotens kan induceres ved tilsætning af kun fire gener i voksne somatiske celler. Da iPSCs er "fremkaldt" fra modne somatiske celler, kan de undgå etiske spørgsmål, der engang havde været den bekymring vedrørende …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| 24-well Plate | TPP | 92024 | |
| PBMC Isolation Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blood cell media |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blood cell media supplement (100x) |
| iPSC Generation and Culture Materials | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Media | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC media |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Colony detaching solution |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Rinse Buffer |
| Sodium Chloride | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Rinse Buffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Rinse Buffer |
| Hydrochloric Acid | Duksan | 1129 | Rinse Buffer |
Riferimenti
- Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).
- Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).
- Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).
- Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).
