Индуцированные плюрипотентные поколение стволовых клеток из клеток крови с помощью вируса Сендай и центрифугирование
Summary
We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.
Abstract
Недавнее развитие человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) доказали, что зрелые соматические клетки могут вернуться к недифференцированной, плюрипотентного состояния. Теперь, перепрограммирование осуществляется с различными типами взрослых соматических клеток: кератиноциты, клетки мочи, фибробласты и т.д. Ранние эксперименты обычно с помощью дермальных фибробластов. Тем не менее, это потребовало инвазивной хирургической процедуры, чтобы получить фибробласты от пациентов. Следовательно, подвесные клетки, такие как кровь и моча клетки, считались идеальными для перепрограммирования из-за удобства получения первичных клеток. Здесь мы сообщаем эффективный протокол для генерации иПСК из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). Путем покрывать трансдуцированных МНПК последовательно к новой, матрицы с покрытием пластин с помощью центрифугирования, этот протокол может легко обеспечить IPSC колонии. Этот метод также применим к пупочной мононуклеарных клеток пуповинной крови (CBMCs). Это исследование представляет собой простой и эффективный Protocol для перепрограммирования МНПК и CBMCs.
Introduction
Стволовые клетки являются одним из наиболее привлекательных материалов в клинической терапии в течение последних нескольких десятилетий 1. Привлекательные свойства стволовых клеток плюрипотентности и способность к самообновлению. В 1981 году, первые эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) были выделены из эмбриона мыши 2. Однако, когда техника была применена к эмбрионов человека, она столкнулась с рядом этических проблем.
В 2006 году , когда доктор Яманака и его команда перепрограммировали первый плюрипотентные клетки от мышей соматических клеток, поле стволовых клеток вновь обрела возможность и интерес был реанимирован 3. Предоставляя несколько определенных факторов, плюрипотентные стволовые клетки были успешно "индуцированные" из взрослых соматических клеток, и, таким образом, были названы "индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК)." В 2007 году этот метод был применен к клеткам человека 4, получая клетки с точными характеристиками ЭСК , но ни одна из этических дискуссий. Теоретически, плюрипотентныхCs могут быть получены из любого типа клеток, полученной из любого индивидуума или пациента. Специфическая для пациента иПСК растут как потенциальный инструмент, который может имитировать фенотипа заболевания и эпигенетических условия каждого отдельного пациента. Использование редактирования гена или другие методы , которые могут полностью изменить патогенное состояние, иПСК конкретного пациента , также может быть использован в персонифицированной медицины 5. Кроме того, иПСК менее связаны с иммунным отторжением , потому что они имеют один и тот же иммунный идентичность в качестве донора, что делает автоматической трансплантации более осуществимыми 6. Поэтому иПСК стали наиболее перспективной платформой в моделировании заболеваний, скрининга лекарственных средств и регенеративной терапии. С учетом этих преимуществ, улучшенные протоколы, которые могут дать более чистым и более высокие урожаи в наименьшее количество времени от самого маленького источника клеток постоянно находятся в стадии разработки. Одним из главных факторов найти наиболее эффективный протокол для будущего применения является тип первичной ячейкой. Большинство ранних иПСК поколения протосмещ_по_столбцам оптимизированы для адгезивных клеток , так как оригинальные IPSC линии были вызваны из фибробластов кожи 4. Тем не менее, выделение и получение этих клеток являются трудоемкими. Кроме того, выделение фибробластов кожи включает в себя инвазивных хирургических процедур, которые могут стать одним из основных недостатков для более широкого применения.
Таким образом, для дальнейшего использования ИПСК, источник клеток с удобным приобретением требуется. Кровь рассматривается как идеальный источник клеток , так как она получена через довольно минимально инвазивные процедуры 7-9. В данном исследовании мы разработали простую модификацию протокола генерации hiPSCs из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). Без сложного процесса расширения определенного типа клеток, таких как клетки CD34 +, целые клетки крови или PBMC, серийно высевали на матричных пластинок, покрытых центрифугированием после трансдукции с вирусом Сендай, содержащим Яманака факторы. Этот метод уменьшило время, необходимое дляприсоединение трансдуцированных плавающих клеток и снижение потерь перепрограммировать клетки, которые не смогли прикрепить на свои собственные.
Protocol
Representative Results
Discussion
Так как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) показал несколько недостатков, требовалось необходимость альтернативного инструмента. Таким образом, развитие индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) путем Яманака попал под международный центр внимания. Прошло почти десят?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| 24-well Plate | TPP | 92024 | |
| PBMC Isolation Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blood cell media |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blood cell media supplement (100x) |
| iPSC Generation and Culture Materials | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Media | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC media |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Colony detaching solution |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Rinse Buffer |
| Sodium Chloride | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Rinse Buffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Rinse Buffer |
| Hydrochloric Acid | Duksan | 1129 | Rinse Buffer |
Riferimenti
- Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).
- Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).
- Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).
- Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).
