הסרה של<em> תסיסנית</em> רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח Immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות
Summary
מחקרים של המורפוגנזה העצבית באמצעות arborization הדנדריטים הזחל תסיסנית (da) נוירונים ליהנות להדמיה באתרו של חלבונים עצביים ו אפידרמיס על ידי immunofluorescence. אנו מתארים הליך המשפר ניתוח immunofluorescence של דה נוירונים ותאי אפידרמיס סביב על ידי הסרת רקמת שריר מקיר גוף הזחל.
Abstract
נוירונים arborization הדנדריטים הזחל תסיסנית (דה) הם מודל פופולרי על חקירת מנגנוני המורפוגנזה העצבית. נוירונים דה להתפתח תקשורת עם תאי אפידרמיס הם מעצבבים ובכך יתרונות הניתוח שלהם להדמיה באתרו של שני החלבונים הביעו neuronally ו epidermally ידי immunofluorescence. שיטות מסורתיות של הכנת פילת זחל לניסויי immunofluorescence להשאיר על כנו את רקמת השריר שמכסה את רוב קיר הגוף, הצגת מספר אתגרי הדמית חלבונים עצביים ו אפידרמיס. כאן אנו מתארים שיטה להסרת רקמת שריר מן פילת זחל תסיסנית. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של חלבונים כי הם מוסתרים אחרת על ידי רקמת שריר, משפר יחס אות לרעש, ומקל על שימוש במיקרוסקופ ברזולוצית סופר ללמוד דה פיתוח נוירון.
Introduction
נוירונים arborization הדנדריטים זחל תסיסנית (da) לספק מודל ערך ללימוד פיתוח עצבי בשל amenability שלהם מניפולציה גנטית ואת הקלות שבה הם יכולים להיות צלמו. עצב סנסורי אלה כבר סייע בזיהוי מסלולים רבים השולטים דנדריט morphogenesis 1-3.
ארבע כיתות של דה נוירונים (אני בכיתה – IV) המעצבבים האפידרמיס הזחל. נוירונים אלה שיוותרו בין קרום במרתף ואת האפידרמיס, עם הדנדריטים שלהם ויוצרים מערכים דו מימדי בעיקר 4,5. של ארבע כיתות, נוירונים דה IV סוג יש סוכות מסועפת מאוד ביותר, כמו עצב סנסורי של בעלי חיים אחרים, פירוט של סוכות אלה מחייב גורמים פנימיים כמו גם רמזים מרקמות שכנות, במיוחד האפידרמיס, להתפתחותם 6-9 .
מחקרים כדי לקבוע כיצד כגון עצבי עובדה נוספת עצביתORS לשלוט תועלת המורפוגנזה דנדריט מהיכולת לזהות ביטוי חלבון באתרו על ידי immunofluorescence. לציפורן החיצוני של הזחל הוא בלתי חדיר נוגדנים, אבל מניעה זו היא להתגבר בקלות על ידי הכנת פילת זחל באמצעות שיטות לנתיחה ומבוססות 10,11. עם זאת, רקמת השריר בגוף הקיר שנמצאה רק פנים אל הקרום במרתף מציגה מספר אתגרים כלפי להדמיה של נוירונים דה ותאי אפידרמיס. ראשית, רקמת השריר, אשר הקווים ביותר של קיר הגוף, מטשטשים אותות ניאון מאוד שמקורם ברקמה עצבית או אפידרמיס. זה מפחית באופן משמעותי את יחס האות לרעש במדגם. שנית, חלבונים רלוונטיים רבים עשויים לבוא לידי ביטוי ברקמת השריר כמו גם בתאי העצב או האפידרמיס. אותות קרינת נגזרות שריר זה עשוי זיהוי מעורפל נוסף של אות קרינה מן הנוירון או האפידרמיס. לבסוף, ההתקדמות בטכנולוגיות מיקרוסקופיה לאהדמית יתר w של דגימות ברזולוצית המשנה דיפרקציה וכן עשויה להיות מועילה במיוחד הבחנת הלוקליזציה של חלבונים אשר מתבטאים בנוירונים והסביבה תא אפידרמיס 12,13. עם זאת, הדמיה באמצעות הטבות מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה מ איתות חזקה יחס רעש בסמיכות של המדגם כדי coverslip. בנוסף הפחתת יחס האות לרעש, מרחקי שריר קיר גוף הזחל דה נוירונים מן coverslip, וכך להגביל את רזולוציית תמונה המשופרת שניתן להשיג עם שיטות מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה. מלבד אתגרים לניתוח immunofluorescence, רקמת שריר מציגה מחסום הקלטת אלקטרו מן עצב סנסורי בקיר גוף הזחל. הסרתו ולכן הטבות מניפולציה הנוירופיזיולוגיים של עצב סנסורי 14.
הנה שיטה להסרה ידנית של רקמת שריר זחל תסיסנית מתוארת. אנו מראים כי p הפרוטוקול שלנוהדמיה immunofluorescence ermits של חלבונים כי הם מוסתרים אחרת על ידי רקמת שריר, משפר את יחס אות לרעש להדמיה של נוירונים דה IV בכיתה, ומאפשר את השימוש במיקרוסקופ סופר-רזולוציה להפלות יחסים מרחבית טובה יותר של חלבונים ומבנים הסלולר דה נוירונים האפידרמיס.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנה פרוטוקול מתואר על הסרה ידנית של רקמת שריר מן פילת זחל תסיסנית. פרוטוקול זה משנה תאר טכניקות לנתיחת זחל בעבר 10,11. לאחר הזחל גזור בצלחת אלסטומר סיליקון, קו אמצע הגב ממוקם. ראש חץ מלקחיים יחיד, באורינטציה האפשרית השטוח שלה, מוכנס בזהירות בין רקמת השריר ואת ה…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים גארי לאייבסקי לדיונים מועילים על מיקרוסקופיה. עבודה זו מומנה על ידי NIH מענקים R01GM061107 ו R01GM067758 כדי ERG
Materials
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22×22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
Riferimenti
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth. Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).
- Meltzer, S., et al. Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons. Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (57), e3111 (2011).
- Gustafsson, J. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data. Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).
- Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae. PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
