제거<em> 초파리</em감각 뉴런과 표피 세포의 면역 형광 분석을위한 애벌레 필렛에서> 근육 조직
Summary
초파리 애벌레 수지상 arborization (다) 신경 세포를 사용하여 신경 세포의 형태 형성의 연구는 면역에 의해 신경 세포와 표피 단백질의 현장 시각화 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 애벌레 몸 벽에서 근육 조직을 제거하여 다 신경 세포와 주변 표피 세포의 면역 형광 분석을 개선하는 절차를 설명합니다.
Abstract
초파리 애벌레 수지상 arborization (다) 신경 세포는 신경 세포의 형태 형성의 메커니즘을 조사하는 인기 모델입니다. 다 신경 따라서 표피가 신경을 분포시키다 세포와 면역에 의해 모두 neuronally 및 epidermally 발현 된 단백질의 현장 시각화에서 자신의 분석 혜택과 통신 개발한다. 면역 실험 애벌레 필렛을 준비하는 전통적인 방법은 신경 세포와 표피 단백질 이미징 몇 가지 과제를 제시, 신체 벽의 대부분을 덮고있는 근육 조직을 그대로 둡니다. 여기에서 우리는 초파리 애벌레 필레에서 근육 조직을 제거하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은, 달리 근육 조직에 의해 가려 단백질의 촬상을 가능하게 신호 대 잡음 비를 향상시키고, DA 신경 발달을 연구 초해 현미경의 사용을 용이하게한다.
Introduction
초파리 애벌레 수지상 arborization (다) 신경 세포는 그들의 유전자 조작에 복종 할 의무 그들이 이미지화 할 수있는 용이성에 신경 발달을 연구하기위한 귀중한 모델을 제공합니다. 이 감각 뉴런은 수상 돌기의 형태 형성 1-3을 제어하는 다양한 경로의 식별 수단이되고있다.
다 뉴런의 네 가지 클래스 (클래스 I – IV) 애벌레 표피 신경을 분포시키다. 이러한 신경 세포는 수상 돌기는 주로 2 차원 배열을 형성 4,5-으로 기저막와 표피 사이에 놓여. 네 개의 클래스, 클래스 IV 다 신경 세포는 다른 동물의 감각 뉴런과 같은 가장 높은 분기 아버과를 가지고,이 아버의 동화는 개발 6-9에 대한 주변 조직에서 고유 요소뿐만 아니라 큐, 특히 표피가 필요합니다 .
연구 방법 등의 연결 및 추가-신경 사실을 확인하는 방법ORS 면역 형광에 의해 반응계 내에서 단백질 발현을 검출하는 능력에서 수지상 형태 형성 이득을 제어한다. 유충의 외부 표피는 항체에 꿰 뚫을 수없는, 그러나이 장애는 쉽게 잘 확립 된 해부 방법 10, 11을 통해 애벌레 필렛의 준비에 의해 극복된다. 그러나, 기저막 단지 내부 놓여 체벽 근육 조직 DA 신경 세포 및 상피 세포의 가시화를 향해 여러 과제를 제공한다. 우선, 근육 조직, 체벽 대부분 라인은 크게 신경 또는 표피 조직에서 나오는 형광 신호를 가린다. 이것은 실질적으로 샘플 신호 대 잡음비를 감소시킨다. 둘째, 많은 관련 단백질은 근육 조직에서뿐만 아니라 신경 세포 또는 표피에서 발현 될 수있다. 이 근육 유래 형광 신호는 신경 세포 또는 표피에서 형광 신호의 상기 모호한 검출 쉽다. 마지막으로, 아니 현미경 기술의 발전서브 회절 해상도에서 샘플 w 허가 이미징 및 상피 세포 (12, 13)를 신경 세포에서 발현되는 단백질의 현지화 안목과 주변에 특히 도움이 될 수 있습니다. 그러나 잡음비 및 커버 슬립을 시료의 근접에 강한 신호로부터 초해 현미경 이점 통해 촬상. 신호 대 잡음 비를 감소 이외에 유생 체벽 근육 거리시켜 초 해상 현미경 방법으로 달성 될 수있는 개선 된 이미지 해상도를 한정 커버 슬립에서 DA 뉴런. 면역 형광 분석을위한 과제 외에도, 근육 조직은 애벌레 몸 벽에 감각 뉴런에서 전기 생리 기록에 대한 장벽을 제공합니다. 그것의 제거는 따라서 감각 뉴런 (14)의 신경 생리 학적 조작 도움이됩니다.
여기 초파리 유충 근조직의 수동 제거하는 방법이 기재되어있다. 우리는 우리의 프로토콜 페이지 입증그렇지 근조직 의해 가려 단백질 ermits 면역 촬상 클래스 IV 다 뉴런의 시각화를위한 신호 대 노이즈 비율을 개선하고, 더 나은 DA 신경 단백질 및 세포 구조의 공간적 관계를 식별하기 위해 초해 현미경의 사용을 가능하게하며 표피.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기 프로토콜 초파리 유충 필렛의 근조직의 수동 제거를 위해 설명된다. 이 프로토콜은 이전에 애벌레 해부 기술 10, 11 설명 수정합니다. 유충은 실리콘 엘라스토머 접시에 해부 한 후, 지느러미 중간 선이 있습니다. 단일 셉 가닥은, 그 평탄한 가능한 방향으로 조심스럽게 지느러미 중간 선 근처의 근육 조직과 표피 사이에 삽입됩니다. 포셉 부드럽게 관심의 각 애벌레 세그먼트에…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 현미경에 도움이 토론 게리 Laevsky 감사합니다. NIH에 의해 투자 된이 작품은 ERG에 R01GM061107 및 R01GM067758을 부여
Materials
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22×22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
Riferimenti
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