の除去<em>ショウジョウバエ</em感覚ニューロンおよび表皮細胞の免疫蛍光分析のための幼虫の切り身から>筋肉組織
Summary
ショウジョウバエの幼虫の樹状樹枝状（DA）ニューロンを用いて、神経細胞の形態形成の研究は、免疫蛍光によって、神経や表皮タンパク質のその場可視化で恩恵を受ける。私たちは、幼虫の体壁から筋肉組織を除去することにより、ダニューロンと周囲の表皮細胞の免疫蛍光分析を向上させる手順を説明します。
Abstract
ショウジョウバエの幼虫の樹状樹枝状（DA）ニューロンは、神経形態形成のメカニズムを調べるための人気モデルです。 DAニューロンは、彼らが免疫蛍光によってタンパク質を発現し、両方のneuronallyと表皮のその場可視化から支配するので、それらの分析の利点表皮細胞と通信して開発しています。免疫蛍光実験のための幼虫フィレットを製造する従来の方法は、ニューロンおよび表皮タンパク質を画像化するためにいくつかの課題を提示し、体壁の大部分をカバーする筋肉組織をそのまま残します。ここでは、 ショウジョウバエの幼虫の切り身から筋肉組織を除去する方法について説明します。このプロトコルは、他の方法で筋肉組織によって覆い隠されているタンパク質の画像化を可能にする信号対雑音比を改善し、DAニューロンの発達を研究するための超解像顕微鏡の使用を容易にします。
Introduction
ショウジョウバエの幼虫の樹状樹枝状（DA）ニューロンは、それらの遺伝子操作に従順し、それらが画像化することができる容易さに神経発達を研究するための貴重なモデルを提供します。これらの感覚ニューロンは、樹状突起の形態形成1-3を制御する多数の経路の同定に尽力してきました。
ダニューロンの4つのクラス（クラスI – IV）幼虫の表皮を支配します。これらのニューロンは、それらの樹状突起が大きく二次元アレイ4,5を形成することで、基底膜と表皮の間にあります。 4つのクラスのうち、クラスIV DAニューロンは、最も高度に分岐したアーバを持っていると、他の動物の感覚ニューロンのように、これらのアーバーの精緻化は、本質的な要因だけでなく、その開発6-9ため、隣接組織からの合図、特に表皮を、必要とします。
どのような神経細胞や余分な神経事実を決定するための研究ORS免疫蛍光法により、in situでタンパク質の発現を検出する能力の樹状突起の形態形成効果を制御します。幼虫の外側のキューティクルは、抗体に不可解ですが、この障害は、簡単に十分に確立された解剖法10,11を介して幼虫のフィレットの作成によって克服されます。しかし、基底膜のすぐ内側にある体壁筋肉組織は、DA神経細胞と表皮細胞の可視化に向けていくつかの課題を提示します。体壁のほとんどは、非常に神経または上皮組織から発せられる蛍光シグナルを不明瞭線まず、筋肉組織、。これは、実質的に、試料中の信号対雑音比を低下させます。第二に、多くの関連タンパク質は、筋肉組織ならびに神経細胞または表皮で発現させてもよいです。この筋肉由来の蛍光シグナルは、ニューロンまたは表皮からの蛍光シグナルのさらなる曖昧検出する可能性があります。最後に、無顕微鏡技術の進歩サブ回折分解能で試料のワット許可イメージングと神経細胞と周囲の上皮細胞12,13に発現されるタンパク質の局在を見分ける際に特に有用であろう。しかし、雑音比とカバースリップに、試料の近接に強い信号から超解像顕微鏡の利点を介してイメージング。信号対雑音比を減少させることに加えて、幼虫の体壁筋の距離それによって超解像顕微鏡法を用いて達成することができる改善された画像の解像度を制限するカバースリップからのDAニューロン。免疫蛍光分析のための課題に加えて、筋肉組織は、幼虫の体壁内の感覚ニューロンからの電気生理学的記録に対する障壁を提示します。その除去は、したがって、感覚ニューロン14の神経生理学的な操作に利益をもたらします。
ここでショウジョウバエ幼虫の筋肉組織を手動で除去するための方法が記載されています。私たちは、プロトコルPことを実証していますさもなければ筋肉組織によって覆い隠されているタンパク質のermits免疫蛍光イメージングは、クラスIV DAニューロンの可視化のための信号対雑音比を向上させ、より良いDAニューロンにおけるタンパク質及び細胞構造の空間的関係を判別する超解像顕微鏡法の使用を可能と表皮。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、プロトコルは、ショウジョウバエの幼虫の切り身から筋肉組織を手動で除去するために記載されています。このプロトコルは、以前幼虫の解剖技術10,11を説明し修正します。幼虫は、シリコーンエラストマー皿に切開した後、背側正中線が配置されています。単一鉗子プロングは、その平坦可能な向きに、慎重に背側正中線近くに、筋組織と表皮との間に挿入されま…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは顕微鏡上で有用な議論のためのゲイリーLaevskyに感謝します。 NIHによって資金を供給されたこの作品は、ERGにR01GM061107とR01GM067758を付与します
Materials
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22×22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
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