Misura parallela di circadiano Clock espressione genica e la secrezione dell'ormone in colture cellulari primarie umane
Summary
Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.
Abstract
orologi circadiani sono funzionali in tutti gli organismi sensibili alla luce, consentendo un adattamento al mondo esterno anticipando cambiamenti ambientali giornalieri. Notevoli progressi nella nostra comprensione della stretta connessione tra l'orologio circadiano e la maggior parte degli aspetti della fisiologia è stato fatto nel settore negli ultimi dieci anni. Tuttavia, dipanando la base molecolare che sottende la funzione dell'oscillatore circadiano nell'uomo rimane di massima sfida tecnica. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un approccio sperimentale a lungo termine (2-5 giorni) di registrazione bioluminescenza e la raccolta media deflusso in cellule primarie umane in coltura. A questo scopo, abbiamo trasdotte cellule primarie con un reporter luciferasi lentivirale che è sotto il controllo di un gene promotore core clock, che consente la valutazione parallela della secrezione ormonale e bioluminescenza circadiani. Inoltre, si descrivono le condizioni per interrompere l'orologio circadiano in prcellule umane imary di transfezione siRNA OROLOGIO targeting. I nostri risultati sulla regolazione circadiano della secrezione di insulina da isole pancreatiche umane, e Myokine la secrezione da parte delle cellule muscolari scheletriche umane, sono qui presentati per illustrare l'applicazione di questa metodologia. Queste impostazioni possono essere utilizzati per studiare la composizione molecolare di orologi periferici umani e di analizzare il loro impatto funzionale su cellule primarie in condizioni fisiologiche o fisiopatologiche.
Introduction
Il sistema di distribuzione circadiano (dal latino "Circa diem") è emerso in tutti gli organismi sensibili alla luce, come un meccanismo di adattamento alla rotazione della Terra. Nei mammiferi, è organizzato in modo gerarchico, che comprende l'orologio centrale, che si trova nel nucleo soprachiasmatico dell'ipotalamo ventrale e periferico (o slave) oscillatori che sono operativi in diversi organi. Inoltre, queste cellule autonome oscillatori auto-sostenuta sono funzionali in quasi ogni cellula del corpo 1. Segnali fotica rappresentano un segnale di sincronizzazione dominante (Zeitgeber) per i neuroni SCN, mentre segnali neurali e umorali provenienti dal SCN ripristinati gli orologi periferici. Inoltre i ritmi di attività-riposo, che guidano in cicli di alimentazione-digiuno di direzione, sono ulteriori sincronizzatori per orologi periferici 2. Secondo la nostra conoscenza attuale, la composizione molecolare del core clock si riferiscono al trascrizionale e TRADUCEanelli di retroazione zionali, che sono conservati tra gli organismi. Questo comprende gli attivatori trascrizionali Bmal1 e orologio, che insieme attivare la trascrizione dei geni negativi core clock PER and Cry. Alti livelli di PER e proteine CRY inibiscono la propria trascrizione attraverso l'inibizione del complesso / CLOCK BMAL1. Un circuito ausiliario è costituito dai recettori nucleari REV-erbs e specchi, che regolano anche la trascrizione di BMAL1 e CLOCK. Inoltre, gli eventi post-traduzionali tra fosforilazione, sumoylation, acetilazione, O-GlcNAcylation, il degrado e l'ingresso nucleare delle proteine core clock rappresentano un importante livello normativo aggiuntivo che istituisce la 24 ore ciclo di oscillazione 3.
Prove accumulando deriva da studi in modelli di roditori e mette in evidenza il ruolo fondamentale del sistema circadiano nel coordinamento delle funzioni metaboliche ed endocrine 4-5. Un certo numero di large-scala analisi del trascrittoma suggeriscono che l'alimentazione – cicli di digiuno svolgono un ruolo centrale nella sincronizzazione degli oscillatori periferici 6-8. In un accordo con questi studi, analisi metabolomica e lipidomico nei roditori e nell'uomo hanno rivelato che un gran numero di metaboliti oscillare nei tessuti, plasma, e saliva in modo circadiano 9-11. È importante sottolineare che la maggior parte degli ormoni mostrano ritmi circadiani in 5,12-13 sangue. Inoltre, gli orologi circadiani del corrispondente ormone che produce tessuti periferici potrebbero regolare la secrezione dell'ormone a livello locale. Oscillatori circadiani cellule autonome sono stati descritti in roditori e pancreatiche umane isolotto cellule 14-16. Questi oscillatori svolgono un ruolo essenziale nella regolazione del trascrittoma di isole pancreatiche e la funzione 15,17-18. Inoltre, Myokine secrezione da miotubi scheletrici umani è stato recentemente dimostrato di esibire un ritmo circadiano, che è regolata da oscillato cellula-autonomars operative in queste cellule 19.
Diversi approcci per studiare ritmi circadiani nell'uomo in vivo sono stati ampiamente utilizzati. Per esempio, la melatonina plasma o livelli di cortisolo, così come la temperatura superficiale della pelle del torace (rivisto in riferimenti 3,20) sono stati studiati per valutare gli orologi circadiani endogeni. Anche se questi metodi consentono lo studio delle oscillazioni circadiani sistemica in vivo, sono lungi dal fornire una valutazione affidabile dei ritmi circadiani autonome free-running in diversi organi e tessuti. Tuttavia, tale dissezione dalla regolazione sistemica sarebbe uno strumento indispensabile per comprendere l'effetto specifico di orologi molecolari intracellulari sulla funzione di queste cellule. Di conseguenza, un notevole sforzo è stato intrapreso per sviluppare approcci affidabili per lo studio orologi umane in cellule in coltura immortalizzate o primari sincronizzati in vitro. Importante, è stato dimostrato checaratteristiche di clock misurata in cellule primarie di fibroblasti cutanei riflettono da vicino le singole proprietà di clock di tutto l'organismo 21. Lo sviluppo di giornalisti circadiani fluorescenti e bioluminescenti è notevolmente avanzato questo approccio 22-27. Inoltre, studiando gli orologi cellulari primarie che sono derivati da diversi organi periferici consente per lo studio delle proprietà molecolari di orologi specifici tessuti umani 3,5,16,19-20,28. Quindi, la valutazione di orologi circadiani in espianti primari sincronizzati in vitro o cellule, utilizzando reporter bioluminescenti, rappresenta un metodo molto utile per studiare la composizione molecolare di orologi periferici umani e il loro impatto sulla funzione degli organi.
In questo articolo, vi presenteremo protocolli dettagliati per valutare l'espressione genica circadiani nelle cellule delle isole primaria e muscolo scheletrico umano sincronizzati in vitro, così come l'impatto di orologio cellulare autonomainterruzione sulla funzione secretoria di queste cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le impostazioni sperimentali qui descritte sono composti di consegna lentivirale di reporter bioluminescenza circadiani in cellule primarie umane coltivate, seguita da successiva sincronizzazione in vitro e registrazione continua della bioluminescenza per diversi giorni, e analisi parallela della secrezione dell'ormone dalle stesse cellule. Essi rappresentano un approccio efficace per esplorare i meccanismi molecolari e gli aspetti funzionali di orologi circadiani nelle cellule primarie umane.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati ai nostri colleghi presso l'Università di Ginevra: Jacques Philippe per i commenti costruttivi su questo lavoro, Ueli Schibler aiuto prezioso con lo sviluppo del sistema perifusione e di ispirazione scientifica, André Liani per aver ideato il design, la produzione e la messa in funzione di il sistema di perfusione, società Lesa-TECHNOLOGY LTD per l'assistenza nel sistema perifusione e Drip-biolumicorder lo sviluppo del software, George Severi per l'assistenza con gli esperimenti perifusione, Ursula Loizides-Mangold per la lettura critica del manoscritto, e Anne-Marie Makhlouf per i preparati lentivirus ; a Etienne Lefai, Stéphanie Chanon e Hubert Vidal (INSERM, Lione) per la preparazione di mioblasti primari umani; e di Domenico Bosco e Thierry Berney (Essere umano Islet Transplantation Center, Ginevra Ospedale universitario) per la fornitura di isole umane. Questo lavoro è stato finanziato dal n Science Foundation nazionale svizzero di Grant 31003A_146475 / 1, il Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No. CRSII3-154405, Fondation Romande pour la Recherche sur Diabète, Bo HJELT Foundation, Fondazione Ernst et Lucie Schmidheiny, e Société Académique de Genève (CD).
Materials
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate – glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch | |
Riferimenti
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