Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas
Summary
Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.
Abstract
relógios circadianos são funcionais em todos os organismos sensíveis à luz, permitindo uma adaptação ao mundo externo, antecipando mudanças ambientais diárias. progressos consideráveis na nossa compreensão da estreita ligação entre o relógio circadiano e a maioria dos aspectos da fisiologia tem sido feito no campo ao longo da última década. Entretanto, desfazendo a base molecular que está na base da função do oscilador circadiano em humanos permanece mais elevada do desafio técnico. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada de uma abordagem experimental para o longo prazo (2-5 dias) de gravação bioluminescência e coleta médio saída em células primárias humanas cultivadas. Para este fim, temos transduzidas células primárias com um repórter de luciferase de lentivírus que está sob o controle de um promotor do gene do núcleo do relógio, o que permite a avaliação paralela de secreção hormonal e bioluminescência circadiano. Além disso, descrevemos as condições para interromper o relógio circadiano no prcélulas humanas imary por transfecção siRNA CLOCK segmentação. Nossos resultados sobre a regulação circadiana da secreção de insulina pelas ilhotas pancreáticas humanas e Myokine secreção pelas células de músculo esquelético humano, são aqui apresentados para ilustrar a aplicação desta metodologia. Essas configurações podem ser usadas para estudar a composição molecular de relógios periféricos humanos e analisar o seu impacto funcional em células primárias em condições fisiológicas ou fisiopatológicas.
Introduction
O sistema de temporização circadiano (do latim "Circa diem") surgiu em todos os organismos sensíveis à luz, como um mecanismo adaptativo à rotação da Terra. Nos mamíferos, ele é organizado de uma maneira hierárquica, englobando o relógio central, que está situado no núcleo supraquiasmático do hipotálamo ventral e periférica (ou secundário) osciladores que se encontram em vigor nos diferentes órgãos. Além disso, estes osciladores autónomos auto-sustentadas de células são funcionais em quase todas as células do corpo 1. Sinais fóticas representam uma sugestão de sincronização dominante (Zeitgeber) para os neurônios SCN, enquanto que os sinais neurais e humorais que emanam do SCN repor os relógios periféricos. Em ritmos de repouso-atividade de adição, que dirigem em ciclos de alimentação-jejum, por sua vez, são outros sincronizadores para relógios periféricos 2. De acordo com o nosso conhecimento actual, a composição molecular do clock do núcleo é baseada na transcrição e translaçãoloops de feedback adicionais, que são conservadas entre organismos. Esta inclui os activadores de transcrição BMAL1 e CLOCK, que juntos ativam a transcrição dos genes negativos núcleo de clock por e chorar. Altos níveis de PER e proteínas Cry vai inibir a sua própria transcrição através da inibição do complexo / CLOCK BMAL1. Um circuito auxiliar consiste nos receptores nucleares REV-ERBs e Rors, que também regulam a transcrição de BMAL1 e CLOCK. Além disso, os eventos pós-translacionais, incluindo a fosforilação, sumoylation, acetilação, O-GlcNAcylation, a degradação ea entrada nuclear das proteínas do núcleo do relógio representam uma camada de regulamentação adicional importante no estabelecimento do 24 hr ciclo de oscilação 3.
Evidências acumuladas resulta de estudos em modelos de roedores e destaca o papel crítico do sistema circadiano na coordenação das funções metabólicas e endócrinas 4-5. Um número de large-escala transcriptoma análise sugerem que a alimentação – ciclos jejum desempenhar um papel central na sincronização dos osciladores periféricos 6-8. Num acordo com estes estudos, a análise metabolômico e lipidomas em roedores e seres humanos revelaram que um grande número de metabolitos oscilar em tecidos, plasma, saliva e de um modo circadiano 9-11. É importante ressaltar que a maioria dos hormônios apresentam ritmos circadianos em 5,12-13 sangue. Além disso, relógios circadianos do hormônio correspondente produzindo tecidos periféricos pode regular a secreção hormonal localmente. Osciladores circadianos Cell-autónoma foram descritos em roedores e células de ilhéus pancreáticos humanos 14-16. Estes osciladores desempenham um papel essencial na regulação do transcriptoma de ilhotas pancreáticas e função 15,17-18. Além disso, Myokine secreção por miotubos esqueléticos humanos tem sido recentemente demonstrada a exibir um padrão circadiano, que é regulada por osciladores de células-autônomaRS operatórias nestas células 19.
Várias abordagens para estudar ritmos circadianos em humanos in vivo têm sido amplamente utilizados. Por exemplo, a melatonina plasma ou níveis de cortisol, bem como a temperatura da superfície da pele torácica (revisto em referências 3,20) foram estudados para avaliar relógios circadianos endógenos. Embora estes métodos permitem estudar oscilações circadiano sistêmicos in vivo, eles estão longe de fornecer uma avaliação fiável dos ritmos circadianos autónomas free-running em diferentes órgãos e tecidos. No entanto, como dissecção da regulação sistêmica seria uma ferramenta indispensável para compreender o efeito específico de relógios moleculares intracelulares sobre a função destas células. Portanto, um esforço substancial tem sido empreendido para desenvolver abordagens confiáveis para estudar relógios humanos em cultura de células imortalizadas ou primárias sincronizados in vitro. Mais importante, foi demonstrado quecaracterísticas relógio medidos em células de fibroblastos da pele primária cultivadas reflecte fielmente as propriedades de clock individuais de todo o organismo 21. O desenvolvimento de repórteres circadianos fluorescentes e bioluminescentes avançou fortemente esta abordagem 22-27. Além disso, os relógios que estudam células primárias que são derivadas de diferentes órgãos periféricos permite a investigação das propriedades moleculares de relógios específicos de tecidos humanos 3,5,16,19-20,28. Assim, a avaliação dos relógios circadianos in vitro explantes ou células primárias sincronizados, usando repórteres bioluminescentes, representa um método muito útil para estudar a composição molecular de relógios periféricos humanos e seu impacto na função do órgão.
Neste artigo, vamos apresentar protocolos detalhados para avaliar a expressão do gene circadiano nas células das ilhotas primário e músculo-esquelético humano sincronizados in vitro, bem como o impacto do relógio celular autónomaperturbações da função secretora destas células.
Protocol
Representative Results
Discussion
As configurações experimentais aqui descritos são compostos de fornecimento de lentivírus de repórteres bioluminescência circadianos em células primárias humanas cultivadas, seguido por sincronização subsequente in vitro e gravação contínua de bioluminescência durante vários dias, e a análise paralela de secreção da hormona pelas mesmas células. Eles representam uma abordagem eficiente para explorar os mecanismos moleculares e aspectos funcionais dos relógios circadianos em células primári…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos aos nossos colegas da Universidade de Genebra: Jacques Philippe para comentários construtivos sobre este trabalho, Ueli Schibler para ajuda inestimável com o desenvolvimento do sistema perifusão e de inspiração científica, André Liani para o ter concebido o projeto, fabricação e comissionamento de o sistema de perfusão, empresa Lesa-Technology LTD para a assistência no sistema perifusão e desenvolvimento de software Drip-biolumicorder, George Severi para assistência com os experimentos perifusão, Ursula Loizides-Mangold pela leitura crítica do manuscrito, e Anne-Marie Makhlouf para preparações lentivírus ; de Etienne Lefai, Stéphanie Chanon e Hubert Vidal (INSERM, Lyon) para a preparação de mioblastos primários humanos; e Domenico Bosco e Thierry Berney (Human Islet Transplantation Center, Hospital Universitário de Genebra) para a prestação de ilhotas humanas. Este trabalho foi financiado pelo No. Swiss National Science Foundation Grant 31003A_146475 / 1, o Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No. CRSII3-154405, Fondation pour la Recherche Romande sur Diabète, Bo Hjelt Foundation, Fundação Ernst et Lucie Schmidheiny e Sociedade Acadêmica de Genebra (CD).
Materials
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate – glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch | |
Riferimenti
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