Parallell Måling av biologiske klokke genekspresjon og hormon i Human primære cellekulturer
Summary
Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.
Abstract
Biologiske klokka er funksjonelle i alle lys-sensitive organismer, noe som åpner for en tilpasning til den ytre verden ved å forutse daglige miljøendringer. Betydelig fremgang i vår forståelse av den tette forbindelsen mellom biologiske klokke og de fleste aspekter av fysiologi har blitt gjort på feltet det siste tiåret. Men rakne det molekylære grunnlaget som ligger til grunn funksjon av circadian oscillator hos mennesker forblir av høyeste teknisk utfordring. Her gir vi en detaljert beskrivelse av en eksperimentell tilnærming for langsiktig (2-5 dager) bioluminescence opptak og utstrømming medium samling i dyrkede humane primære celler. For dette formål har vi transdusert primære celler med en lentiviral luciferase reporter som er under styring av en klokke kjerne-gen-promoteren, som tillater den parallelle vurderingen av hormon og circadian bioluminescens. Videre beskriver vi betingelsene for å forstyrre biologiske klokke i primary humane celler ved transfeksjon siRNA rettet mot klokken. Våre resultater på circadian regulering av insulinsekresjon av humane pankreatiske øyer, og myokine sekresjon av human skjelettmuskelceller, er presentert her for å illustrere anvendelsen av denne metodikken. Disse innstillingene kan brukes til å studere den molekylære sammensetningen av humane perifere klokker og å analysere deres funksjonelle innvirkning på primærceller under fysiologiske eller patofysiologiske forhold.
Introduction
Circadian timing system (fra latin "Circa diem") har dukket opp i alle lys-sensitive organismer, som en adaptiv mekanisme for å rotasjonen av jorden. Hos pattedyr er det organisert i en hierarkisk måte, som omfatter den sentrale klokke, som ligger i suprachiasmatic kjernen av ventral hypothalamus, og perifer (eller slave) oscillatorer som er operative i ulike organer. Dessuten, disse cellestyrte selvbærende oscillatorer er funksjonelle i nesten hver eneste celle i kroppen en. Photic signaler representerer en dominerende synkroniserings cue (zeitgeber) for SCN neuroner, mens nevrale og humoral signaler som kommer fra SCN nullstille perifere klokker. I tillegg hvile-aktivitet rytmer, som driver i sin tur fôring-faste sykluser, er ytterligere synchronizers for perifere klokker 2. Ifølge vår nåværende forståelse, er den molekylære sammensetningen av kjernen klokke basert på transkripsjonen og omregningelle tilbakemeldinger looper, som er konservert mellom organismer. Dette omfatter transkripsjonsaktivatorer BMAL1 og klokke, som sammen aktiverer transkripsjon av de negative kjerneklokke PER og gråte gener. Høye nivåer av PER og CRY proteiner vil hemme sin egen transkripsjon gjennom hemming av BMAL1 / CLOCK kompleks. En hjelpe sløyfe består av nukleære reseptorer REV-ERBs og på speil, som også regulerer transkripsjon av BMAL1 og KLOKKE. Videre posttranslational arrangementer, inkludert fosforylering, sumoylation, acetylering, O-GlcNAcylation, degradering og kjernekraft oppføring av kjerneklokke proteiner representerer et ekstra viktig regulerende lag i å etablere 24-timers pendling syklus 3.
Samle bevis stammer fra studier i gnagermodeller og fremhever den viktige rollen circadian system i koordineringen av metabolske og endokrine funksjoner 4-5. En rekke large-skala transkriptomet analyse tyder på at fôring – faste sykluser spille en sentral rolle i synkroniseringen av perifere oscillatorer 6-8. I en avtale med disse undersøkelser har metabolomic og lipidomiske analyse i gnagere og mennesker viser at et stort antall av metabolitter oscillerer i vev, plasma, spytt og i en cirkadisk måte 9-11. Viktigere, de fleste hormoner vise døgnrytme i blodet 5,12-13. Videre kan biologiske klokka av den tilsvarende hormonproduserende perifert vev regulere hormon lokalt. Cell-autonome circadian oscillatorer har blitt beskrevet i gnager og menneskelige bukspyttkjertel øyceller 14-16. Disse oscillatorer spiller en viktig rolle i reguleringen av bukspyttkjertelen holmen transkriptom og fungere 15,17-18. Videre har myokine sekresjon av menneskelige skjelett myotubes nylig blitt vist å utvise en circadian mønster, som reguleres av celle-autonome oscillatorenrs operative i disse cellene 19.
Flere metoder for å studere cirkadianske rytmer hos mennesker in vivo har vært mye brukt. For eksempel har plasma melatonin eller kortisolnivåer samt thorax hud overflatetemperatur (anmeldt i referanser 3,20) er undersøkt for å vurdere endogene biologiske klokka. Selv om disse metodene kan studere systemiske circadian svingninger i vivo, de er langt fra å gi en pålitelig vurdering av fritt kjører autonome døgnrytme i ulike organer og vev. Ikke desto mindre vil en slik disseksjon fra den systemiske reguleringen være et uunnværlig verktøy for å forstå den spesifikke virkning av intracellulære molekylære klokker på funksjonen av disse cellene. Derfor har en betydelig innsats blitt gjennomført for å utvikle pålitelige metoder for å studere menneskelige klokker i immortaliserte eller primære dyrkede celler synkroniserte in vitro. Viktigere er det blitt demonstrert atklokke egenskaper målt i dyrkede primære hud fibroblast celler tett gjenspeile de enkelte klokke egenskapene til hele organismen 21. Utviklingen av fluorescerende og selvlysende circadian journalister har mye avansert denne tilnærmingen 22-27. Videre studerer primære celle klokker som er avledet fra forskjellige perifere organer gir mulighet for etterforskningen av de molekylære egenskaper av menneskelig vev-spesifikk klokker 3,5,16,19-20,28. Dermed vurdering av biologiske klokka i in vitro synkroniserte primære explants eller celler, ved hjelp av bioluminescent reportere, representerer en svært nyttig metode for å studere den molekylære sammensetningen av humane perifere klokker og deres innvirkning på organfunksjon.
I denne artikkelen vil vi presentere detaljerte protokoller for vurdering av circadian genuttrykk i menneskelige primær holmen og skjelettmuskelceller synkroniserte in vitro, samt effekten av autonome mobilklokkeavbrudd på den sekretoriske funksjon av disse cellene.
Protocol
Representative Results
Discussion
De eksperimentelle innstillingene som er beskrevet her er sammensatt av lentiviral levering av circadian Bioluminescens reportere i dyrkede humane primære celler, etterfulgt av påfølgende in vitro synkronisering og kontinuerlig opptak på bioluminesens i flere dager, og parallell analyse av hormonutskillelse av de samme cellene. De representerer en effektiv metode for å utforske molekylære mekanismer og funksjonelle aspekter av biologiske klokka i humane primære celler.
Kvalit…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for at våre kolleger fra Universitetet i Genève: Jacques Philippe for konstruktive kommentarer til dette arbeidet, Ueli Schibler for uvurderlig hjelp med utviklingen av perifusion system og for vitenskapelig inspirasjon, André Liani for å ha unnfanget design, produksjon og ferdigstilling av perfusjon system, Lesa-Technology LTD selskap for bistand i perifusion system og Drip-biolumicorder programvareutvikling, George Severi for å få hjelp med perifusion eksperimenter, Ursula Loizides-Mangold for kritisk lesing av manuskriptet, og Anne-Marie Makhlouf for lentivirus forberedelser ; til Etienne Lefai, Stéphanie Chanon og Hubert Vidal (INSERM, Lyon) for å forberede menneske primære myoblasts; og til Domenico Bosco og Thierry Berney (menneskelig Islet Transplantasjon Center, Genève universitetssykehus) for å gi menneskelige holmer. Dette arbeidet ble finansiert av den sveitsiske National Science Foundation Grant No. 31003A_146475 / 1, Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No. CRSII3-154405, Fondation Romande pour la Recherche sur diabète, Bo Hjelt Foundation, Fondation Ernst et Lucie Schmidheiny og Société académique de Genève (CD).
Materials
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate – glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch | |
Riferimenti
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
- Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
- Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
- Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
- Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
- McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
- Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
- Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
- Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
- Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
- Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
- Hastings, M., O’Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
- Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
- Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
- Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
- Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
- Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
- Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
- Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
- Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
- Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
- Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
- Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
- Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
- Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
- Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
- Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).
