We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.
基因表达平台测定允许在一个单一的反应高达800转录物(mRNA或微RNA)的表达的健壮和高度可再现的定量。 miRNA的检测直接成像和数字计算的标有颜色编码荧光条码探针集(记者探针和捕获探针)miRNA分子计数成绩单。条形码直接杂交成熟已拉长通过连接一个独特的寡核苷酸标签(miRtag)到3'末端的miRNA。不需要逆转录和转录的扩增。报告探针包含使用四种荧光颜色的组合填充六色的位置的序列。四种颜色在六个位置被用来构建基因特异的彩色条形码序列。杂交后处理机器人准备站自动化。杂交,多余的探针被冲走,而三方结构(采集专业后待的miRNA报告探针)被固定到通过生物素标记的捕捉探针的链霉抗涂覆滑动。成像和条形码数量使用数字分析仪完成的。固定化的条形码的miRNA可视化并使用显微镜和照相机成像,以及独特的条形码被解码并计数。数据质量控制(QC),归一化,并分析由附带测定软件定制设计的数据处理和分析软件促进。该试验证明了在宽范围的表达的高线性度,以及高的灵敏度。样本制备和分析制备不涉及酶反应,逆转录或扩增;有几个步骤;并且在很大程度上自动化,减少了研究者的影响,并导致高的一致性和技术可重复性。在这里,我们描述了在肠易激综合症识别循环的miRNA扰动这种技术的应用。
肠易激综合症(IBS)是在胃肠病学中最常见的门诊诊断,困扰10 – 总人口的15%,较健康服务显著负担。对IBS目前,没有普遍公认的诊断标志物(即诊断根据临床症状和排除其他器质性疾患,如胃肠恶性肿瘤,炎性肠疾病和胃肠(GI)感染)。当研究在与亚临床病理学的一般条件,如肠易激综合征,高灵敏度和精确度(再现性)的基因表达谱需要,如在基因表达谱扰动常细微1-3。 miRNA的已被确定为IBS 4,5诊断和功能目标,我们在评估其作为循环IBS-相关的生物扰动3,4,6,7的生物标志物的使用特别感兴趣。 circula的临床应用鼎生物标志物是当前关心的是由于易用性和病人生物标志物'源(如外周血)集合的微创性。
基因表达平台测定法,因为其独特的化学和精简,大多自动化工作流程的,提供一种微阵列平台,提供转录靶向发现的宽和可定制的覆盖范围(在单一反应800目标)。他们还产生高精确度和线性度的表达水平在转录目标量化范围广泛。该测定不需要的RNA的逆转录,得到的cDNA,或任何其它酶反应的扩增。因此,从低丰度或稀有的剪接变异体RNA扩增品种的高循环次数引入潜在的错误是由数字计数的过程中减少。这意味着,各种样品类型,例如纯化总的的RNA( 即,mRNA的+ miRNA)的,RNA从福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的标本,以及粗组织和细胞裂解物,可以与测定中使用。
利用一对探针(捕获和报告探针),每个都包含识别关于靶RNA的对应区域的特定靶序列被检测感兴趣的RNA。为了确保短的RNA( 即,微RNA)的检测,所述成熟miRNA序列通过退火一个独特的寡核苷酸标签(miRtag)到该分子的3'末端延伸。桥接寡核苷酸,其互补于两个成熟靶miRNA和miRNA特异性miRtag的一部分,是用来确保序列特异性。捕获和报告探针分别结扎的3'和5'成熟miRNA-miRtag复杂的结束。捕获探针具有在3'端的生物素标签,这允许它们附加到链霉抗镀膜玻璃载玻片的表面上,FIXI纳克捕获探针的miRNA-miRtag,记者探头复杂的幻灯片。然后电流用来定向在滑动表面上的复合物,使由报告探针的5'端进行荧光条形码使用显微镜和电荷耦合器件(CCD)照相机来可视化。条形码进行计数和解码,产生特定靶miRNA的计数。萤光条形码包含可以通过四个荧光颜色之一占据六个位置,它可以被用来构造4000彩色条形码组合,每编码一个特定的RNA。
样品制备( 即,RNA纯化或细胞/组织裂解物制剂),以及捕获和报告探针的杂交,以替补进行。十二标本可以在一个幻灯片复用。隔夜杂交后,所有进一步的样品制备是通过机器人准备站进行。然后将装载载玻片传送到广告igital分析器用于成像,计数,解码和数据处理。所得数据被导入到附带的软件,在那里它们被进一步具有高度的用户控制的处理。独特的化学,制备简单,自动性质,简单的数据类型(计数),以及测定的总体简化的工作流程便于高精度基因表达的定量,使得它在功能性病症如学习循环miRNA的表达谱和签名的有用工具肠易激综合征。
该议定书中的关键步骤
特别是对于所述miRNA测定中,关键是不使用未纯化的裂解物(这些可以在mRNA和蛋白测定中使用的)中,作为试剂尚未用于裂解物进行了优化,和样品制备的反应很可能被抑制。此外,污染物从裂解和RNA纯化步骤( 例如,胍化合物,乙醇和酚类)结转可抑制结扎和样品纯化的反应。良好品质的RNA因此与miRNA测定的灵敏度和准确度的关键。
使用热循环与加热的盖是至关重要的,以确保适当的温度控制,以优化的所有反应步骤的性能。在步骤3.5.1,它不以除去由热循环条,以便在加入连接酶的过程中,保持温度是重要的。除去条带以添加连接酶将损害该反应。当执行杂交步骤,重要的是,避免剧烈摇动,移液,或轻弹在管混合试剂时,因为这会剪切报告探针。为了确保最佳的性能和一致性,通过温和轻弹调匀在管试剂是重要的。总是降速反应混合后,并使用新的移液管每次试剂分注以确保准确的吸液和,以避免意外的交叉污染时翻倒。
修改和故障排除
可定制的代码集,包括感兴趣的只有目标。以这种方式,成本可以平衡,以允许对大量样品的检测时进一步调查或验证生物签名。自定义探针可设计为基因或目标不能从菜单点菜 。灵敏度丰裕少目标或低浓度的RNA可以通过允许更长的杂交时间和/或通过使用较高分辨率的数字计数操作。
在我们的研究中,我们使用,从全血中的总RNA预定的800靶miRNA面板;但是,可以自定义的试验,包括更少的miRNA如果需要更有针对性的做法。共有24个样品可在一天制备,在两组12的交错,因为两个盒可以舒适地通过杂交后处理机器人准备站上通过,并在第二天对数字分析仪成像。在12批次样品的交错处理重要的是要规范杂交时间。已拍摄墨盒可以保存并在 4℃将重新扫描存储的数据是否分析认为,较高的分辨率扫描可能会提高罕见的miRNA的检测。罕见分子的检测也可通过为更长的杂交样品改善;然而,长期的杂交可能resul吨过饱和,并且可以仅提高的结果,如果在开始的RNA浓度低(如在细胞外囊泡衍生的RNA)。该平台的灵敏度和精确度允许相对低丰度的miRNA,以可靠地计量。
该技术的局限性
所描述的基因表达分析平台只可容纳高达每组800目标。因此,它不适合整体的miRNA转录/全转录组的研究。唯一已知的,描述的,并且可以使用平台来检测指定的目标,因此,它不适合于新的分子物种的发现。其它方法,如RNA测序或其他传统的微阵列的方法,更适合于全转录探索性研究。
关于到现有/替代方法的技术意义
IBS的特征在于症状的组合,首席cipally包括腹痛;内脏敏感性;和大便习惯,如频繁腹泻,便秘,或两者9,10的组合的变化。 IBS症状没有已知的器质性原因,和病人不与临床显著炎症,胃肠组织,或全身性标志物9-12的病理扰动出现。研究表明,在IBS生物失调是潜移默化的,亚临床和异类,与新兴的共同主题周围炎症和免疫功能的10。因此,我们需要控制实验者引入变化,并使用了一个平台,是能够在基因表达可靠地检测细微扰动。试验和系统的独特属性规范来样加工,减少实验者通过自动化处理,减少了技术差异产生高度可重复的数据。这些特点保证了重点调查,并生产高精密和Replicable数据。这允许检测可能由更丰富的目标的信号被忽略或淹没低表达目标之间微妙扰动和扰动的使用强度 – 或扩增为基础的方法时。基于PCR的微阵列和RNA测序方法是可行的替代方案使用所描述的平台和当需要更高的吞吐量,或者可以是作为替代的吸引力,当目的是表征全转录或以寻找新的分子。然而,替代品可能无法准确,灵敏地检测和定量稀有的目标和微妙的扰动进行为好。
掌握这一技术后,未来的应用方向或
在IBS参与者循环miRNA表达呈数目被发现是既显著和类别内是一致的扰动。该鉴定的miRNA与相关通道法相关YS和病理状况,包括功能性疼痛病症(的miR-342-3p:慢性膀胱疼痛)8和炎症(的miR-150)13。本例研究是基于用于定义目标和利益的系统的探索队列。然后,更有针对性的,更小的miRNA阵列构造,降低了每个样品的成本并允许更大的同伙以符合成本效益的方式,以验证和优化的签名和生物标志物进行分析。基因表达平台测定系统撞击微阵列的传统探索性质和更有针对性,假设驱动的数据收集来优化和测试分子签名和生物标记14-16之间的平衡。该方法将被用于检查分子和蛋白质的扰动在体内和体外模型,其中所述靶miRNA是实验过表达或抑制。新测定法允许的mRNA和p的同时定量直接从细胞和组织裂解液roteins。此外,通过优化的外周血和排泄物(例如尿)的特定级分的纯化和通过定制和优化某些测定参数,分子型材和低分子浓度的级分( 例如,外来体的级分)的特征将被检查。
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge funding from the U.S. Department of Health and Human Services, the National Institutes of Health, the National Institute of Nursing Research, and the Division of Intramural Research to Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; the Intramural Research Training Awards to Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, and Leeanne B. Sherwin; and special support from the Burroughs Wellcome Fund to Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace.
The opinions expressed herein and the interpretation and reporting of these data are the responsibility of the author(s) and should not be seen as an official recommendation, interpretation, or policy of the National Institutes of Health or the United States Government.
nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
Pipettes (1000, 100, 20, 10ul) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
nSolver | Nanostring | N/A | Essential |