在活细胞悬浮液荧光测定G蛋白选择性GPCR构象测量使用FRET传感器
Summary
Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, Fӧrster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.
Abstract
Fӧrster共振能量转移（FRET）基中的GPCR信号传导的调查研究已变得越来越普遍。我们的研究小组开发出一种分子内FRET传感器来检测Gα亚基及以下激动剂刺激活细胞G蛋白偶联受体之间的相互作用。在这里，我们对细节处理后用100μM盐酸异丙将β2肾上腺素能受体和GαsC端肽的检测FRET变化协议作为以前的特点1。我们FRET传感器是由一个全长的GPCR，一个FRET受体荧光团（mCitrine）的串联的单个多肽，一个ER / K痉挛（系统蛋白亲和力强度调制）连接体，FRET供体荧光团（mCerulean）和GαÇ末端肽。该协议将详细介绍细胞制备，转染条件，设备安装，试验执行和数据分析。这个实验设计检测小通道安格斯在FRET指示蛋白质 – 蛋白质相互作用，并且也可以用来比较相互作用的跨越配体和G蛋白偶联受体，G蛋白配对的强度。增强信号噪声中的测量，该协议要求在所有步骤升高的精度，并且在这里提出，以使重现的执行。
Introduction
G蛋白偶联受体（GPCR）是七跨膜受体。人类基因组中单独含有约800个基因编码的GPCR，这是通过各种配体包括光，添味剂，激素，肽，药物和其它的小分子激活。目前市场上的目标GPCR的所有药品的近30％，因为他们在许多疾病状态2发挥很大的作用。尽管几十年来对这个受体家族丰富的工作经验，有留在场上显著悬而未决的问题，特别是关于推动GPCR-效应相互作用的分子机制。迄今为止，只有一个高分辨率晶体结构已发表 ，提供洞察β2 -肾上腺素能受体（β2 -AR）和G蛋白3之间的相互作用。在过去的三十年的广泛研究一起，它重申一个具体结构部件即临界在此互动：Gα亚基C端。这种结构是两个G蛋白活化的GPCR 4和G蛋白选5-6重要。因此，GαC端提供了GPCR的配体刺激和选择性激活G蛋白之间的关键环节。
研究在过去十年中表明的GPCR填充广泛的构象的风景，配体结合的稳定的GPCR的构象的子集。虽然若干技术，包括结晶，核磁共振和荧光光谱，和质谱可用来检查GPCR的构象的风景，有办法一个缺乏以阐明在效应选择7的功能意义。这里，我们概述一个Fӧrster共振能量转移（FRET）基的方法来检测G蛋白选择性GPCR的构象。 FRET依赖于两个荧光团的接近和平行取向具有重叠发射（供体）一次激励（受体）谱8。作为供体和受体荧光团来靠得更近如蛋白质或任一构象变化的蛋白质-蛋白质相互作用的结果，它们之间的FRET增加，并且可以使用各种方法8进行测量。基于FRET的生物传感器已经在GPCR领域9广泛应用。他们已被用于在第三细胞内环和GPCR C端插入供体和受体，探讨在G蛋白偶联受体构象变化;传感器被设计用FRET对10分开贴标GPCR和效应（G蛋白亚基/抑制蛋白）来探测GPCR和效应的相互作用;一些传感器也检测所述G蛋白11的构象变化。这些生物传感器已经启用了现场询问，包括在GPCR和构象变化的效应，GPCR-效应相互作用动力学和变构配体12悬而未决的问题，众说纷纭。我们的组在创建一个能检测激动剂驱动的条件下，g的蛋白构象GPCR生物传感器特别感兴趣。这种生物传感器依靠命名为痉挛（系统蛋白亲和强度调制）13最近开发的技术。 SPASM涉及到使用ER / K连接，控制它们的有效浓度圈养相互作用蛋白结构域。侧翼带有FRET对荧光团的链接器创建一个工具，它可以报告蛋白12之间的相互作用的状态。先前1使用了痉挛模块到GαC-末端系绳到GPCR并监控其与FRET的荧光团的相互作用，mCitrine（通过其通常已知的变体，黄色荧光蛋白（YFP），激发/发射峰在提及的这个协议525分之490纳米）和mCerulean，激发/发射峰四百七十五分之四百三十零纳米）（由它的俗称变种青色荧光蛋白（CFP在本协议中提到的）。从N至C末端，T他的遗传编码的单一多肽包含：全长GPCR，FRET受体（mCitrine / YFP），10纳米的ER / K连接体，FRET供体（mCerulean / CFP）和GαC-末端肽。在这项研究中，传感器被简称为GPCR-接头长度-Gα肽。所有部件都通过一个非结构（甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸）4连接子，使每个域的自由旋转分离。以前用两个典型的G蛋白偶联受体进行此类传感器的详细特征：β-AR和视蛋白1。
此传感器被瞬时转染到HEK-293T细胞和基于荧光 – 活细胞实验的FRET对中在存在或不存在配位体的每秒（CPS）计数的任意单位的测量荧光光谱。这些测量用于计算荧光团（YFP 最大值 / CFP 最大值 ）之间的FRET比率。在FRET（ΔFRET）的变化，然后减去平均FRET比率计算从配体处理的样品的FRET比率的未处理的样品。 ΔFRET可以跨结构进行比较（β-AR-10纳米Gαs肽与β-AR-10纳米无肽）。这里，我们详细协议来表达活的HEK-293T细胞，这些传感器，监视它们的表达，并安装，执行，和基于荧光 – 活细胞的分析FRET测量未处理与药物处理的条件。虽然该协议是专用于与100μM的异丙酒石酸氢盐处理的β2 -AR-10纳米Gαs肽传感器，它可以为不同的GPCR-Gα对和配体进行优化。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这个系统中FRET测量的严密动态范围强化敏感的质量控制在本协议中的每一个步骤的必要性。以确保成功的FRET实验的最重要的步骤是：1）细胞培养，2）转染3）蛋白表达和4）及时，准确协调的测定执行期间。
细胞的健康和维护/电镀质量可以对实验系统和差细胞健康的信号 – 噪声一个显著影响可以使它不可能检测在FRET任何一致的变化。保守，细胞是健康的大约20代，虽然这?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RUM是由美国心脏协会前博士生奖学金（14PRE18560010）的资助。研究是由美国心脏协会的科学家开发格兰特（13SDG14270009）美国国立卫生研究院（1DP2 CA186752-01与1-R01-GM-105646-01-A1），以资助SS
Materials
| B2-AR-10 nm- Gas peptide sensor | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Elute in 2 mM Tris elution buffer |
| HEK-293T-Flp-n cells | Life Technologies | R78007 | |
| Trypsin (0.25%) | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM- high glucose | Life Technologies | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| FBS, certified, Heat inactivated, US origin | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media; Bring to room temperature before use |
| XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | Highly recommended for its consistency. Bring to room temperature before use |
| FluoroMax 4 | Horiba | Use with FluorEssence V3.8 software | |
| 3-mm path length quartz cuvette | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna |
| Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump | Fisher Scientific | 13-874-826 | Warm to 37 °C before use |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Warm to 37 °C before use |
| Ultrapure DNA/RNAse free water | Life Technologies | 10977015 | Use at room temperature |
| D(+)-glucose, anhydrous | Sigma | G5767 | |
| aprotinin from bovine lung | Sigma | A1153 | |
| leupeptin hemisulfate | EMD | 10-897 | |
| L-ascorbic acid, reagent grade | Sigma | A0278 | |
| (-)-isoproterenol (+)-bitartrate | Sigma | I2760 | Use fresh aliquot each experiment |
Riferimenti
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