G-Protein-selektive GPCR Konformationen gemessen mit FRET-Sensoren in einer Live Cell Suspension Fluorometer Assay
Summary
Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, Fӧrster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.
Abstract
Fӧrster Resonanzenergietransfer (FRET) -basierte Studien immer häufiger bei der Untersuchung von GPCR-Signal geworden sind. Unsere Arbeitsgruppe entwickelte ein intramolekularen FRET-Sensor die Wechselwirkung zwischen Ga-Untereinheiten und GPCRs in lebenden Zellen nach Agonist Stimulation zu erkennen. Hier stellen wir ausführlich das Protokoll für die Veränderungen in der FRET zwischen dem β 2 -adrenergen Rezeptor und dem Gαs C-Terminus – Peptid bei der Behandlung mit 100 & mgr; M Isoproterenolhydrochlorid Erfassen gekennzeichnet zuvor 1. Unsere FRET-Sensor ist ein einzelnes Polypeptid, das aus seriell von einer Volllängen-GPCR, einem FRET-Akzeptor-Fluorophor (mCitrine), eine ER / K SPASM (systematische Protein-Affinitätsstärke modulation) Linker, einem FRET-Donor-Fluorophor (mCerulean) und eine G & agr; C -terminalen Peptid. Dieses Protokoll wird ausführlich Zellpräparation, Transfektionsbedingungen, Geräte-Setup, Testausführung und Datenanalyse. Dieses experimentelle Design erkennt kleine changes in FRET indikativ für Protein-Protein-Wechselwirkungen und kann auch verwendet werden, die Stärke der Interaktion zwischen den Liganden und GPCR-G-Protein-Paarungen zu vergleichen. Um das Signal-Rausch-in unseren Messungen zu verbessern, Dieses Protokoll erfordert erhöhte Präzision in allen Schritten, und wird hier präsentiert, um reproduzierbare Durchführung ermöglichen.
Introduction
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind sieben-Transmembran-Rezeptoren. Das menschliche Genom enthält etwa 800 allein Gene kodierend für GPCRs, die durch eine Vielzahl von Liganden, einschließlich Licht, Geruchsstoffe, Hormone, Peptide, Arzneimittel und andere kleine Moleküle aktiviert werden. Fast 30% aller Arzneimittel auf dem Markt Ziel GPCRs , weil sie eine große Rolle spielen bei vielen Krankheitszuständen 2. Trotz jahrzehntelanger intensiver Arbeit an dieser Rezeptorfamilie getan, gibt es weiterhin erhebliche offene Fragen auf dem Gebiet, vor allem im Hinblick auf die molekularen Mechanismen, die GPCR-Effektor-Wechselwirkung fahren. Bis heute hat nur eine hochauflösende Kristallstruktur veröffentlicht worden sind , einen Einblick in die Wechselwirkung zwischen dem β 2 -adrenergen Rezeptor Bereitstellung (β 2 -AR) und das Gs – Protein 3. Zusammen mit den umfangreichen Forschung in den letzten drei Jahrzehnten, wiederholt sie eine spezifische strukturelle Komponente, die in dieser kritischen istInteraktion: der C-Terminus G & agr; -Untereinheit. Diese Struktur ist wichtig für die G – Protein – Aktivierung durch den GPCR 4 und G – Protein – Auswahl 5-6. Daher stellt die G & agr; C-Terminus eine entscheidende Verbindung zwischen Ligand Stimulation des GPCR und selektive Protein-Aktivierung G.
Forschung im letzten Jahrzehnt legt nahe, dass GPCRs eine breite Konformationsänderungen Landschaft bevölkern, mit Ligand-bindenden Untergruppen von GPCR Konformationen zu stabilisieren. Während verschiedene Techniken, einschließlich Kristallographie, NMR und Fluoreszenzspektroskopie und Massenspektrometrie sind verfügbar , um die GPCR Konformationsänderung Landschaft zu untersuchen, gibt es einen Mangel von Ansätzen ihre funktionelle Bedeutung in Effektor Auswahl 7 zu erläutern. Hier beschreiben wir eine Fӧrster Resonanzenergietransfer (FRET) -basierte Ansatz G-Protein-selektive GPCR Konformationen zu erkennen. FRET stützt sich auf die Nähe und die parallele Ausrichtung von zwei Fluorophore mit überlappenden Emissions (Donor) einnd Anregung (Akzeptor) Spektren 8. Als Donor und Akzeptor – Fluorophore kommen einander näher als Ergebnis entweder Konformationsänderung im Protein oder ein Protein-Protein – Wechselwirkung erhöht die FRET zwischen ihnen, und 8 mit einer Reihe von Verfahren gemessen werden. FRET-basierten Biosensoren wurden 9 ausführlich in der GPCR – Bereich eingesetzt. Sie wurden durch Einfügen Donor und Akzeptor in der dritten intrazellulären Schleife und GPCR C-Terminus in der GPCR Sonde Konformationsänderungen verwendet; Sensoren wurden durch getrennte Markierung des GPCR und Effektorzellen (G – Protein – Untereinheiten / Arrestine) mit einem FRET – Paar 10 zur Sonde GPCR und Effektor – Wechselwirkung entwickelt; Einige Sensoren auch Konformationsänderungen in dem G – Protein 11 erfassen. Diese Biosensoren haben das Feld aktiviert eine Vielzahl von offenen Fragen zu stellen , einschließlich Konformationsänderungen in der GPCR und Effektorzellen, GPCR-Effektor – Wechselwirkung Kinetik und allosterische Liganden 12. Unsere Gruppewar besonders daran interessiert, einen Biosensor zu schaffen, die G-Protein-spezifischen GPCR Konformationen unter Agonisten getriebenen Bedingungen erkennen konnte. Dieser Biosensor beruht auf einer neu entwickelten Technologie SPASM (systematische Protein – Affinitätsstärke Modulation) 13 genannt. SPASM beinhaltet Tethering die Interaktion Proteindomänen ein ER / K-Linker mit, die ihre wirksamen Konzentrationen kontrolliert. Flankierend den Linker mit einem FRET – Paar von Fluorophoren schafft ein Werkzeug , das den Zustand der Wechselwirkung zwischen Proteinen 12 mitteilen. Zuvor 1 wurde das SPASM Modul verwendet , um die G & agr; C-Terminus mit einem GPCR anbinden und überwachen ihre Wechselwirkungen mit FRET Fluorophore, mCitrine (bezeichnet in diesem Protokoll , das von seiner allgemein bekannten Variante Yellow Fluorescent Protein (YFP), Anregungs- / Emissions – Peak bei 490/525 nm) und mCerulean (bezeichnet in diesem Protokoll, das von seiner allgemein bekannten Variante Cyan Fluorescent Protein (GFP), Anregungs- / Emissions-Peak 430/475 nm). Vom N- zum C-Terminus, tseine genetisch kodierte einzelnes Polypeptid enthält: ein in voller Länge GPCR, FRET-Akzeptor (mCitrine / YFP), 10 nm ER / K-Linker, FRET-Donor (mCerulean / CFP) und der G & agr; C-Terminus-Peptid. In dieser Studie Sensoren sind als GPCR-Linker-Länge-G & agr; Peptid abgekürzt. Alle Komponenten werden von einer unstrukturierten (Gly-Ser-Gly) 4 Linker getrennt , die eine freie Drehung jeder Domäne ermöglicht. Die detaillierte Charakterisierung solcher Sensoren wurde durchgeführt , die zuvor zwei prototypische GPCRs mit: β 2 -AR und Opsin 1.
Dieser Sensor ist transfiziert transient in HEK-293T-Zellen und Fluorometer basierten lebenden Zellen Experimente messen Fluoreszenzspektren des FRET-Paares in willkürlichen Einheiten der Zählungen pro Sekunde (CPS) in Gegenwart oder Abwesenheit eines Liganden. Diese Messungen werden verwendet , um ein FRET – Verhältnis zwischen den Fluorophoren (YFP max / CFP max) zu berechnen. Eine Änderung in der FRET (ΔFRET) wird dann durch Subtraktion des durchschnittlichen FRET-Verhältnis berechnetder unbehandelten Proben aus dem FRET Verhältnis von Ligand behandelten Proben. ΔFRET kann über Konstrukte (β 2 -AR-10 nm-Gαs Peptid im Vergleich zu ß 2 -AR-10 nm-kein Peptid) verglichen werden. Hier stellen wir ausführlich das Protokoll, um diese Sensoren in Live-HEK-293T-Zellen exprimieren, überwachen deren Ausdruck und die Einrichtung, Durchführung und Analyse des Fluorometers-basierten Live-Cell-FRET-Messung für unbehandelte gegen Arzneimittel-behandelten Bedingungen. Während dieses Protokoll für den β 2 -AR-10 nm-Gαs Peptidsensor mit 100 & mgr; M Isoproterenol Bitartrat spezifisch ist, kann es für verschiedene GPCR-G & agr; Paare und Liganden optimiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die enge Dynamikbereich von FRET-Messungen in diesem System verstärkt die Notwendigkeit, sensible Qualitätskontrolle bei jedem Schritt dieses Protokolls. Die wichtigsten Schritte ein erfolgreiches FRET Experiment sind 1) die Zellkultur, 2) Transfektion 3) Proteinexpression und 4) zeitnah, präzise Koordination während des Testausführung zu gewährleisten.
Zell Gesundheit und Pflege / Beschichtung Qualität kann einen erheblichen Einfluss auf das Signal-zu-Rausch des experimentellen Syste…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RUM wurde von der American Heart Association Pre-Doc-Stipendium finanziert (14PRE18560010). Forschung wurde von der American Heart Association Scientist Entwicklung Grant (13SDG14270009) & NIH (1DP2 CA186752-01 & 1-R01-GM-105646-01-A1) finanziert SS
Materials
| B2-AR-10 nm- Gas peptide sensor | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Elute in 2 mM Tris elution buffer |
| HEK-293T-Flp-n cells | Life Technologies | R78007 | |
| Trypsin (0.25%) | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM- high glucose | Life Technologies | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| FBS, certified, Heat inactivated, US origin | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning | MT25060CL | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media; Bring to room temperature before use |
| XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | Highly recommended for its consistency. Bring to room temperature before use |
| FluoroMax 4 | Horiba | Use with FluorEssence V3.8 software | |
| 3-mm path length quartz cuvette | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna |
| Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump | Fisher Scientific | 13-874-826 | Warm to 37 °C before use |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Warm to 37 °C before use |
| Ultrapure DNA/RNAse free water | Life Technologies | 10977015 | Use at room temperature |
| D(+)-glucose, anhydrous | Sigma | G5767 | |
| aprotinin from bovine lung | Sigma | A1153 | |
| leupeptin hemisulfate | EMD | 10-897 | |
| L-ascorbic acid, reagent grade | Sigma | A0278 | |
| (-)-isoproterenol (+)-bitartrate | Sigma | I2760 | Use fresh aliquot each experiment |
Riferimenti
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