Triagem para Endocrine Atividade em Água Utilizando disponíveis comercialmente<em> In Vitro</em> Transativação Bioensaios
Summary
A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested (“freeze and thaw”) in vitro transactivation bioassays.
Abstract
Em bioensaios de transactivação in vitro mostraram promissores como ferramentas de monitoramento de qualidade da água, no entanto a sua adopção e aplicação generalizada tem sido dificultada em parte devido à falta de métodos padronizados e disponibilidade de tecnologia robusta, fácil de usar. Neste estudo, as linhas celulares, prendeu-divisão comercialmente disponíveis foram utilizados para rastrear quantitativamente para a actividade endócrina de produtos químicos presentes em amostras de água de interesse para os profissionais de qualidade ambiental. Um protocolo único, padronizado, que incluiu garantia de qualidade / controlo de qualidade (QC / QA) controlos foi desenvolvido para actividade de estrogénio e Receptor de Glucocorticóides (ER e GR, respectivamente), utilizando um ensaio baseado em células de Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência (TERF). Amostras de efluente tratado municipal de águas residuais e das águas superficiais de sistemas de água doce na Califórnia (EUA), foram extraídos utilizando extração em fase sólida e analisados para a atividade endócrina usando o proto padronizadocol. Antecedentes e dose-resposta para as substâncias químicas de referência específicos do endpoint conheceu diretrizes QA / QC consideradas necessárias para a medição confiável. A resposta de rastreio de bioensaio para as amostras de água de superfície não foi detectável em grande parte. Em contraste, amostras de efluentes de estações de tratamento secundário teve a maior actividade mensurável, com concentrações equivalentes bioensaios estimado (BEQ) até 392 ng dexametasona / L para o GR e 17 ng 17β-estradiol / L para ER. O bioensaio de resposta para uma amostra de efluente terciário foi menor do que o medido para os efluentes secundários, indicando uma residual menor de produtos químicos activos endócrinos após o tratamento avançado. Este protocolo mostrou que em bioensaios de transactivação in vitro que utilizam comercialmente disponíveis, células preso por divisão "kits", pode ser adaptado para o rastreio de actividade endócrina em água.
Introduction
monitoramento da qualidade da água corrente baseia-se na capacidade de medir com precisão e precisamente a ocorrência de contaminantes químicos como um proxy para a exposição a animais selvagens e seres humanos. No entanto, esta monitorização química-by-químicas e paradigma de avaliação não pode manter o ritmo com o universo química em constante mudança que enfrentamos. À medida que aprendemos mais sobre o destino e os efeitos dos produtos químicos sintéticos e naturais, continuamos a procurar instrumentos de medição que tratem esperados impactos biológicos, e que ao mesmo tempo são imunes às mudanças na produção de químicos, uso e entrada ambiental. Tais ferramentas são especialmente relevantes para a compreensão se os produtos químicos desconhecidos ou novos, e produtos de transformação, merecem a nossa atenção. Além disso, misturas complexas de produtos químicos presentes na água são pouco abordado pela monitorização química individual. Assim, enfrentamos o desafio de modernizar a caixa de ferramentas de monitoramento existente para melhor enfrentar estas questões nas águas de superfície that receber a descarga de efluentes de esgoto tratado e do escoamento / águas pluviais urbanas.
Nos últimos anos, as técnicas bioanalíticos mostraram-se promissores como ferramentas de triagem para avaliação da qualidade da água. Em particular, os bioensaios, in'vitro que respondem a produtos químicos que actuam via conhecida, modos de acção específicos 1,2 são de grande interesse para a comunidade de monitoramento ambiental 3. Numerosas investigações têm empregado em bioensaios in vitro para quantificar a atividade endócrina de beber, de superfície e águas residuais 4 -6. Além disso, uma série de bioensaios alvo eventos iniciadores moleculares (por exemplo, a activação do receptor), que pode, potencialmente, ser associados a efeitos deletérios através de via adverso resultado analisa 7,8.
A evolução da bioscreening para a avaliação da qualidade da água foi relativamente rápida, com centenas de diferente em endpoints bioensaios in vitro tendo sido avaliados quanto à sua9,10 utilidade. Atualmente, apenas um punhado de bioensaios foram mostrados para alcançar uma boa precisão da medição (em laboratórios), demonstrando a capacidade de diferenciar entre qualidades de água 5,6. Para efluentes de esgoto tratado em particular, a ocorrência de estrogénios e esteróides glicocorticóides tem sido com sucesso contabilizado usando em ensaios de transactivação in vitro 11,12. bioensaios No entanto, a maioria dos estudos até à data têm empregados cujas linhas celulares são proprietários (e, portanto, não estão amplamente disponíveis), requerem cuidados continuados e manipulação, ou ambos. Como resultado, a capacidade de padronizar protocolos, realizar exercícios de calibração inter-laboratoriais, e, finalmente, para transferir essa tecnologia de triagem para os recursos hídricos da Comunidade permanece prejudicada.
Pelo menos um fornecedor de bioensaios in vitro controlados através do programa US ToxCast está disponível comercialmente 13 em fácil de usar "de congelação e descongelação4; formatos. Estes "kits" de células-preso divisão foram mostrados para ser robusto para medir a actividade de produtos químicos extraído da água que representam diferentes níveis de tratamento 14. Embora os protocolos do fornecedor estão disponíveis para pesquisar a bioactividade de produtos químicos individuais ou misturas, alguns deles necessitam de modificação antes de poderem ser aplicados a amostras de água. Efluente tratado de águas residuais 15, escoamento de águas pluviais 16, águas receptoras 17,18 e, mais recentemente reciclado 19,20 água são exemplos de meios aquosos que são de interesse para a comunidade de qualidade da água.
Este estudo apresenta um protocolo único, padronizado para medir a atividade endócrina em amostras de água usando comercialmente disponíveis, por divisão de presos em bioensaios de transactivação in vitro. Nós demonstramos robustez do protocolo através de uma avaliação abrangente de fundo, a dose de responsividade e repetibilidade da resposta para twO endpoints de particular estrogênio juros e glicocorticóides Receptor transativação (ER e GR, respectivamente). O protocolo foi aplicado em amostras de tela de efluentes de esgoto tratado e das águas superficiais de sistemas de água doce na Califórnia.
Protocol
Representative Results
Discussion
A potência bem documentado de estrogênios ambientais, tais como 17β-estradiol (E2), triagem mandados para esses produtos químicos em / L concentrações ng 23,24. Neste estudo, a resposta ER para os efluentes de águas residuais (gama BEQ: 2,3-17 ng E2 / G) era um pouco mais elevada do que a relatada para o efluente secundário de ETAR Australiana 20, ao passo que os BEQ para as águas superficiais (<0,5 a 4 ng E2 / G ) estavam dentro da faixa relatada para a superfície e águas pluviais em…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by State Water Resources Control Board (Agreements No. 10-096-250 and 14-090-270). We thank S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi, and J. Printen. The authors declare no conflict of interest, and reference to trade names does not imply endorsement.
Materials
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96 well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fumehood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. | |||
Riferimenti
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