Bestimmung der relativen Zelloberfläche und Total Expression rekombinanter Ionenkanäle Mit Flow Cytometry
Summary
Ererbten Arrhythmien werden häufig durch Mutationen verursacht, die die Oberfläche Lieferung eines oder mehrerer Ionenkanäle verändern. Hier passen wir die Durchflusszytometrie-Assays eine Quantifizierung der relativen Gesamt und Zelloberflächenproteinexpression von rekombinanten Ionenkanäle in tsa-201-Zellen exprimiert zu liefern.
Abstract
Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.
Introduction
Dieses Dokument bietet einen zuverlässigen Assay, um die relative Zelloberflächenexpression der Membranproteine wie Ionenkanäle exprimiert in rekombinanten Zellen unter Verwendung der bestehenden Technologie Durchflusszytometrie zu melden. Ionenkanäle sind porenbildende Membranproteine, die durch Gating den Fluss von Ionen durch die Zellmembran zum Steuern elektrischer Signale verantwortlich sind. Sie werden durch den Aktivierungsmechanismus, der Natur klassifiziert und Selektivität der Ionenspezies durch die Pore queren, wo sie lokalisiert sind. Auf zellulärer und Gewebespiegel, die makroskopischen Ionenflüsse durch Ionenkanäle sind das Produkt von biophysikalischen (Gating und Permeation), biochemische (Phosphorylierung) und Biogenese (Synthese, Glykosylierung, Menschenhandel und Abbau) Eigenschaften 1. Jedes dieser Verfahren ist einzigartig für jede Art von Ionenkanälen und optimiert wird, um die physiologische Rolle des Ionenkanals zu erfüllen. Folglich Veränderungen in jedem dieser fein abgestimmten Prozesse durch einevererbte oder eine genetische Modifikation, die oft als "Ionenkanal" kann zu Zellhomöostase schädlich sein. Es ist wichtig zu betonen, dass an der Zelloberfläche, die "richtige" Menge an Ionenkanälen liefern zu Zellhomöostase kritisch ist. Selbst kleine Erhöhungen (Gain-of-function) und geringe Abnahmen (loss-of-function) in Ionenkanalaktivität haben das Potenzial, eine ernsthafte Pathologie im Laufe eines Lebens zu verursachen. Defekte in der Zelloberfläche Lieferung von reifen Ionenkanäle ist ein wichtiger Faktor in zahlreichen channelopathies, wie zystischer Fibrose (CFTR Ionenkanal) 2 und Herzrhythmusstörungen des Long – QT – Syndrom Form (kardiale Kaliumkanäle) 3.
Kanalopathien sind mit Herz plötzlichen Tod 4 verbunden. Die aktuelle weltweite Prävalenz aller Herz channelopathies wird angenommen , mindestens 1: 2,000-1: etwa die Hälfte des plötzlichen Herztods arrhythmic ca. 3.000 pro Einzel 5 und sind verantwortlichses 6. Dysfunction in Herzspannungsabhängigen Natrium-, Kalium- und kalzium selektive Ionenkanäle sind dafür bekannt, eine Schlüsselrolle in diesem Prozess spielen. Der L-Typ – Ca V 1.2 spannungsabhängigen Calcium – Kanal erforderlich synchronisiert Herzmuskelkontraktion zu initiieren. Der Herz L-Typ – Ca V 1.2 – Kanal ist ein Multi-Untereinheiten – Proteinkomplex , bestehend aus dem Hauptporenbildenden Ca V α1 – Untereinheit und Ca V SS und V Ca α2δ1 Hilfsuntereinheiten 7-12. Beachten Sie, dass die volle Ergänzung der Hilfsuntereinheiten funktionellen Ca V 1.2 Kanäle an der Plasmamembran und dynamische Wechselwirkungen zu erzeugen erforderlich ist zwischen diese Untereinheiten sind wichtig , die normale elektrische Funktion des Herzens 13 zu unterstützen. Ca V ß fördert die Zelloberflächenexpression von Ca V 1.2 Kanäle , durch eine nicht-kovalente nanomolar hydrophobe Interaktionschromatographie 14. Die Co-Expression des Ca V α2δ1 Untereinheit with Ca V ß-gebundene Ca V α1 stimuliert Spitzenstrom Ausdruck (5 bis 10-fach) und fördert Kanalaktivierung bei negativeren Spannungen. Gain-of-function Mutationen des porenbildende Untereinheit Ca V 1.2 haben mit einer Form von ventrikulären Arrhythmien sogenannte Long – QT – Syndrom 15 , während eine Vielzahl von Punktmutationen in den drei Hauptuntereinheiten bilden , die L-Typ – Ca V 1.2 Kanal zugeordnet worden wurden bei Patienten leiden unter Arrhythmien des Short – QT – Syndrom Form 16,17 identifiziert. Ionenkanäle sind Membranproteine, die aus biochemischer Sicht (Proteinchemie) oder mittels elektro Tools (Stromerzeugungsmaschinen) und häufig diese komplementären Ansätzen untersucht werden können. Electrophysiology, insbesondere Ganzzell – Patch-Clamp ist ein geeigneter Ansatz , um die Funktion von Ionenkanälen 15 zu erläutern , aber nicht lösen können Modifikationen in den Proteintransport durch Veränderungen in ihren biophysikalischenEigenschaften. Proteinchemie hat jedoch häufig den Einsatz aufgrund der relativ geringen Expression großer Membranproteine in Bezug auf kleinere lösliche Proteine beschränkt. Robuste Hochdurchsatzverfahren Fluoreszenzablesung unter Verwendung müssen entwickelt werden, um gezielt Defekte in Proteinbiogenese adressieren Veränderungen in der Zelloberflächenexpression von Ionenkanälen verursacht.
Die Durchflusszytometrie ist ein biophysikalischen Technologie in Zellzählung eingesetzt, das Sortieren, den Nachweis von Biomarkern und Protein – Engineering – 18. Wenn eine Probenlösung von lebenden Zellen oder Partikel in einem Durchflusszytometer eingespritzt wird, werden die Zellen in einen einzigen Strom bestellt, die von der Maschine des Detektionssystems (Figur 1) untersucht werden können. Die erste Durchflusszytometer Instrument 1956 erzeugt 19 detektiert nur einen Parameter , aber moderne Durchflußzytometer weisen mehrere Laser und Fluoreszenzdetektoren, die den Nachweis von mehr als 30 Fluoreszenzparameter 20,21 ermöglichen.Filter und Spiegel (Emissionsoptik) lenken das Licht streuen oder Fluoreszenzlicht von Zellen an ein elektronisches Netzwerk (Photodiode und Detektoren), die das Licht proportional zu seiner Intensität umwandeln. Digitale Daten werden mit spezieller Software analysiert und die primäre Ausgabe wird als Punkt – Diagramm 21 angezeigt.
Abb . 1: Biophysical Prinzipien der Durchflusszytometrie Sortieren einzelner Zellen werden durch eine Düse unter hohem Druck in einem Strom von Hüllflüssigkeit geschoben , der sie bewegt sich über eine oder mehrere Laserabfragepunkten. Der Lichtstrahl wird durch die vorbeifahrenden Zellen umgelenkt und das Licht in der Vorwärtsrichtung gesammelt (Forward Scatter, FCS) auf eine Fotodiode geschickt, die das Licht in ein Signal proportional zur Größe der Zelle umwandelt. Das Licht wird auch in einem 90 ° Winkel zu dem Laserpfad und an Detektoren (auch als Photomultiplier (PMT)) gesammelt.Dieses Licht wird durch den dichroitischen Spiegel geleitet, die die Erkennung des Seitenstreusignal (SSC) zu ermöglichen, die die Granularität innerhalb der Zellen widerspiegelt, und die Fluoreszenzemissionen, wenn erregt Fluorochrome in der Zelle vorhanden sind. Drei Detektoren (grün, gelb und rot) mit unterschiedlichen Wellenlängen-Bandpassfilter dargestellt, so dass die gleichzeitige Detektion von verschiedenen Fluorochromen. Die unterschiedlichen Signale werden von einem externen Computer digitalisiert und in Daten umgewandelt, die die Eigenschaften der Zellen zu quantifizieren analysiert werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die Hochdurchsatzkapazität von Durchflusszytometer wurde die relative Membranexpression von rekombinanten Wildtyp und des Handels-defizienten spannungsabhängigen L-Typ – Ca V 1.2 Kanäle und die damit verbundenen Untereinheiten in lebenden Zellen zu quantifizieren ausgebeutet. cDNA-Konstrukten coding für die Proteine wurden doppelt markiert, um gleichzeitig eine extrazelluläre nichtfluoreszierenden Epitop tragen, die durch eine undurchlässige fluoreszierenden konjugierten Antikörper und einem intrazellulären Fluorophor die konstitutiv fluoresziert detektiert werden kann. Sowohl das extrazelluläre Epitop in einer extrazellulären Schleife des Proteins eingeführt ist, und die intrazelluläre Fluorophor, eingesetzt nach dem C-Terminus mit dem Protein translatiert. In dieser Serie von Experimenten wurde die Ca V α2δ1 proteintechnisch eine extrazelluläre Hämagglutinin (HA) -Epitop (YPYDVPDYA) durch eine undurchlässige FITC (Fluorescein – Isothiocyanat) -konjugiertem anti-HA und mCherry als Intrinsische intrazellulärem Fluorophor detektiert auszudrücken. Um die relative Zelloberflächenexpressionsniveau des mCherry-Ca V α2δ1 HA-markiertes Protein, rekombinante Zellen, die das Fusionsprotein bestimmen , wurden nach der Transfektion geerntet, und gefärbt mit FITC-konjugierten monoklonalen Maus – anti-HA – Epitop – Tag Antibody (Abbildung 2). FITC ist eine organische Fluoreszenzverbindung, die wesentlich kleiner als Enzym-Reporter ist und deshalb nicht so wahrscheinlich mit biologischen Funktion zu stören. mCherry- Ca V α2δ1-HA überexprimiert in Tsa-201cells, erzeugt eine signifikante 3-log Anstieg der FITC – Fluoreszenz und mCherry Fluoreszenz auf zweidimensionalen Plots 22. Da die HA-Epitop in der extrazellulären Teil des Proteins befindet, erhalten die Fluoreszenzintensität für FITC in Gegenwart von intakten Zellen spiegeln die relativen Index der Zelloberflächenexpression von HA-markierten Proteins. Die Zugänglichkeit des HA-Epitops in den Konstrukten wird durch Messung des FITC Signals nach Zellpermeabilisierung systematisch validiert. Auch diese Maßnahme dient der normalisierten Gesamtproteinexpression zu untermauern, da die relativen Fluoreszenzintensitäten für FITC in permeabilisierten Zellen geschätzt sind qualitativ vergleichbar mit den relativen Fluoreszenzwerte for mCherry gemessen unter permeabilisiert und nicht-permeabilisierten Bedingungen 22,23. Es ist wichtig zu beachten, dass die intrinsische Fluoreszenzspektrum zu höheren Werten nach Permeabilisierung verschoben wird, sondern daß der einzige Wert angegeben wird, ist die Änderung in der Fluoreszenzintensität in Bezug auf die Kontrollkonstrukt verglichen. Relative Änderungen in der Fluoreszenzintensität für die Testkonstrukte werden geschätzt die ΔMean Fluoreszenzintensität unter Verwendung von (ΔMFI) Werte für jedes Fluorophor (mCherry oder FITC). Experimente werden die Fluoreszenzintensität des Testkonstrukts relativ zur Fluoreszenzintensität des Kontrollkonstrukts unter den gleichen Bedingungen exprimiert zu messen experimentellen Variationen in der intrinsischen Fluoreszenz des Fluorophors-konjugierten Antikörper zu begrenzen. Zwei Membranproteine wurden erfolgreich mit diesem Test untersucht: das porenbildende Untereinheit des L-Typ spannungsabhängigen Calcium – Kanal – Ca V 1.2 14,22 und in einer anderen Reihe vonExperimente, 22,23 die extrazelluläre Hilfs Ca V α2δ1 Untereinheit. Das folgende Protokoll wurde verwendet , um die Zelloberflächenexpression des Ca V α2δ1 Untereinheit des Herz L-Typ – Ca V 1.2 Kanal unter Kontrollbedingungen und nach Mutationen zu bestimmen , die posttranslationale Modifikation des Ionenkanals beeinflussen. Unter genormten Versuchsbedingungen erhöht die Zelloberfläche Fluoreszenz von FITC quasi-linear mit der Expression der cDNA kodierend für die mCherry-Ca V α2δ1-HA – Proteine (Abbildung 5 aus Lit. 22).
Abbildung 2:. Schematische Darstellung der gesamten und der Membran Kennzeichnung in der Durchflusszytometrie Versuchsprotokoll Das Schema beschreibt einige der wichtigsten Schritte notwendig , um die relativen Gesamt und Zelloberflächenexpression von rekombinanten Ionenkanäle durch fl zu quantifizierenow-Zytometrie. Zellen werden mit dem doppelt markiert Konstruktion mCherry-Ca V α2δ1-HA in TSA-201 – Zellen transfiziert (1) und gefärbt vor oder nach der Permeabilisierung (2). Multi Daten werden in einem Durchflusszytometer (3) für multivariate Analyse (4) übernommen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Durchflusszytometrie basierenden Assay wurde zur Messung der relativen Gesamt und Zelloberflächenniveaus von fluoreszenzmarkierten porenbildenden und die zugehörigen Untereinheiten von spannungsabhängigen Calciumkanälen 14,22,26 erfolgreich angewendet. Es wird verwendet, am besten, wenn die Wirkung der genetischen Mutationen zu untersuchen und somit erfordert, daß die intrinsische Fluoreszenzintensität des fluoreszierend markierten markierten Wildtyp-Konstrukt sein, mindestens 10 bis 100-fach grö…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Serge Sénéchal and Dr. Jacques Thibodeau for sharing their expertise and granting us access to their flow cytometry and cell sorting platform. This work was completed with the operating grant 130256 from the Canadian Institutes of Health Research, a grant-in-aid from the Canadian Heart and Stroke Foundation, and support from the “Fondation de l’Institut de Cardiologie de Montréal” to L.P.
Materials
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523). |
| Tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72-690-001 | |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62-554-002 | |
| Disposable graduated Tranfer Pipets | VWR | 160001-192 | |
| 100-mm culture dish | Corning | 430167 | For standard culture of HEKT cells. |
| 35-mm culture dish | Falcon | 353001 | For standard culture of HEKT cells. |
| Serological pipette 1 ml | Sarstedt | 86.1251.001 | |
| Serological pipette 5 ml | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| Serological pipette 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Serological pipette 25ml | Sarstedt | 86.1285.001 | |
| Dulbecco's high-glucose medium | Life Technologies | 12100-046 | Warm in 37°C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin | Life Technologies | 16140-071 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Warm in 37°C water bath before use. |
| Trypsin-EDTA (1X) 0.05%, phenol red | Life Technologies | 25300-062 | |
| 1.5 mL microtubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Phosphate Buffered Saline 1X | Fisher | BP661-10 | Can be "home-made". |
| Anti-HA FITC conjugated antibody | Sigma | H7411 | |
| IgG1−FITC Isotype Control antibody | Sigma | F6397 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C. |
| Hemacytometer | Fisher | 49105161 | |
| Trypan Blue | Fisher | 15250061 | To access cell viability. |
| Refrigerated Microcentrifuge, 5430R | Eppendorf | A14H172200 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Fisher | 370 | |
| Laboratory Platform Rocker | Fisher | 545034 | |
| Water Bath | VWR | 89032-216 | |
| BD FACSARIA III | BD Biosciences | 648282 | Flow cytometer. |
| FlowJo Software v10 | FlowJo | FlowJo v10 Dongle | For data analysis. |
Riferimenti
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