Summary
理解再内皮的细胞和分子机制下列动脉剥蚀损伤是至关重要的在防止血栓形成和动脉的再狭窄。在这里，我们描述了肾腹主动脉动脉可重复性损伤剥蚀的协议。该程序的开发研究，规范使用小鼠模型内皮细胞再生的基本机制。
Abstract
经皮血管介入均匀导致动脉剥脱伤了随后导致血栓形成和再狭窄。这些并发症可在伤口边缘内再内皮归因于损伤。然而，再内皮的细胞和分子机制仍有待确定。虽然一些动物模型动脉剥脱术后学习再内皮可用，很少在鼠标由于局限性手术来执行。这破坏的机会，以利用转基因小鼠系，并调查特定基因的至再内皮过程中的贡献。在这里，我们提出了一个一步一步的协议中使用外部钳位血管下腹腹主动脉动脉创造剥蚀损伤的高度重复性的小鼠模型。纤维蛋白原和β-catenin的受伤主动脉的免疫细胞化学染色表现出亲血栓表面的暴露ð内皮完整的边界，分别。这里介绍的方法具有速度，优良的整体存活率，和相关技术容易的优点，创造了在转基因小鼠模型强加动脉剥蚀损伤一个唯一实用工具。使用这种方法，调查人员可能阐明正常或病理状态下重新内皮化的机制。
Introduction
血栓形成和再狭窄的患者严重的早期和晚期并发症接受谁经皮血管介入，如血管内球囊成形术1,2。多种策略已经被用来解决这些并发症，尤其是双重抗血小板治疗和药物洗脱支架。然而，很少焦点一直放在血栓形成和再狭窄，内皮细胞覆盖率（剥蚀）即损失的潜在原因。剥蚀损伤是由于机械外伤到血管壁介入过程的必然结果。这种机械创伤可导致损坏和去除基底膜和血管平滑肌的保护内皮细胞层并且暴露于循环血液3。在这些领域中的内皮细胞的损失创建前血栓形成和促炎环境，不仅促进血小板粘附和随后的血栓形成，但LSO刺激迁移，并导致新内膜增厚和狭窄4血管平滑肌细胞的增殖。这些并发症，以及它们的相关的治疗，导致显著发病率，最值得注意的是复发性缺血性疾病和出血事件影响人类健康。
再内皮从伤口边缘的裸露损伤是非常重要的预防血栓形成和再狭窄5。尸检结果和动物模型已经证明有效的减少血栓的发生率与支架支柱覆盖6,7。药物洗脱支架，设计通过抑制平滑肌细胞增殖和内膜增生减少再狭窄率，导致动脉再内皮损伤显著和晚期血栓形成3率持续上升。不幸的是，对于认识再内皮化的机制一直是一个缓慢的过程，由于缺乏AP的主要限于propriate动物模型8。
几种动物模型对于理解下面的动脉损伤血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的作用已创建7,9,10。大鼠颈动脉球囊损伤模型是最好的特点，并已用于研究在总量，细胞和分子水平11剥蚀损伤的作用。然而，具有优良的存活率动脉剥脱伤的高度重复性的小鼠模型的缺少和急需采取的提供给多个设置更好地阐明血管再生多个转基因株系的优势。
这份手稿介绍动脉剥脱伤是可重复的，简单执行的小鼠模型。该方法已经显示出最小的发病率和死亡率在几个转基因株系。因为转基因小鼠系的广泛数量的，该模型可以用于阐明剥蚀损伤后再内皮的分子机制。
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Protocol
注：此协议已在美国加州洛杉矶大学被批准的动物研究委员会。
1.术前准备及麻醉
- 一定要在整个过程中遵守无菌技术。
- 使用消毒蒸汽高压灭菌器的所有手术用品。
- 打开麻醉诱导之前加热啮齿动物手术平台使得它可以温热至在外科手术过程适当的温度（37℃）并置于立体显微镜可视化。
- 鼠标放置在麻醉诱导室，并以1升/分钟的流速，用4％异氟烷诱导。
- 仔细监测小鼠诱导时的呼吸频率和足底皮肤的颜色。
- 呼吸速率的减缓后，从感应腔移开鼠标和放置在外科手术制备以面在2.5％分离鼻锥和维护的异氟烷浓度温热垫。
- 执行脚趾捏来评估麻醉的充分性。
- 应用眼药膏角膜和（5毫克/千克）管理皮下注射术前卡布洛芬。
- 将鼠标仰卧和利用快船从腹部取出的头发。
- 用聚维酮碘的三个交替磨砂和70％异丙醇用无菌纱布垫施加准备手术区。
- 在加热啮齿动物外科手术平台，脸鼻锥将鼠标仰卧和保护所有四肢并仔细鼠标的位置，使腹部与体视显微镜可见。
- 放置无菌粘合剂敷料沿准备手术区域的各边缘。
- 滴定异氟醚浓度在手术过程中保持足够的麻醉，同时保持自主呼吸。
2.下腹主动脉阻断
- 使3厘米的切口向下腹部中线使用手术刀，起始approximatelý0.5厘米劣于剑突。
- 轻轻缩回用钳子皮肤和用细剪刀剪开精结缔组织腹壁皮肤解剖走。
- 应用0.05-0.1毫升0.5％布比卡因对肌壁，使2厘米的切口插入腹壁，露出腹部器官。
- 如果沿腹壁发生出血，应用温和的压力用棉签。
- 轻轻抬起使用生理盐水浸湿棉签涂抹肠子。
注意：小心，以避免在一个温暖，无菌生理盐水纱布浸泡在腹腔外的海绵钝伤空肠回肠动脉和地点。- 覆盖其他温暖，无菌生理盐水浸湿的纱布海绵肠子，以避免水分流失。
- 放置牵开lateralize直肠和暴露后腹膜。
- 将小纱布垫所必需的retroperitone可视化嗯跟踪中使用的数。
- 在右肾下极水平，用锋利的解剖钳做出retroperitonotomy横向到主动脉。
注：小心不要弄伤下腔静脉或周围血管。- 说白了解剖腹膜后组织了主动脉 小心不要穿透下腔静脉或周围血管。
- 放置血管钳在主动脉至少1分钟，或其他指定的时间，并通过目视观察在远端主动脉缺乏搏动的验证闭塞。
- 取出血管钳和验证止血。止血达到和当血液没有活性外渗看出确保。
- 通过加入0.5ml盐水腹腔并且如果盐水日益成为血液微染评估确认外渗。如果是这样的情况下，使用盐水浸泡敷料器1分钟，以确保施加轻柔的压力止血。
- 卸下放置在腹膜后的可视化，以帮助和替换原位肠到腹部的纱布垫。
- 使用预温热的无菌盐水灌溉腹腔。
3.剖腹手术及皮肤闭幕
- 使用5-0编织，吸收单连续缝合关闭腹壁肌肉层。
- 以聚合物粘合剂的1-3滴，然后随后用伤口夹关闭皮肤一旦粘合剂设置。
4.恢复和术后评估
- 鼠标的食物和水转移到恢复笼上一个加热垫在笼底。
- 密切监视鼠标呼吸困难的症状。辖卡布洛芬（5毫克/千克），每日每术后指导机构48小时。
- 不要离开无人看管的动物，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨recumbency。
- 返回鼠标与食物和水的正常笼。
- 不要返回已动过手术，以公司的其他动物，直到完全康复的动物。
- 评估裂开每天伤口，术后14天删除片段。
5.主动脉夹层和染色
- 基于以下剥蚀损伤感兴趣的特定时间点为牺牲选择的小鼠。
- 通过异氟醚牺牲小鼠并立即与5毫克氯乙酰甲胆碱注射引起血管平滑肌松弛。
- 经呼吸停止，缺乏角膜反射和缺乏运动的死亡的确认，灌注4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水在通过左侧心脏心室10分钟100毫米汞柱的灌注压。
- 使用解剖立体显微镜仔细完整的腹主动脉分离开周围组织。
- 横切主动脉喙肾动脉和尾至髂分叉，并通过沿背表面的纵行切口打开。
- 针主动脉平35毫米的硅树脂涂层菜与腔侧为固定时间不少于2小时，但不超过12小时。随后，将组织既可以嵌入用于切片或在连接面整体贴装免疫细胞化学使用。
- 山沾有鲁米那面朝上玻片的共聚焦显微镜盖玻片主动脉。
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Representative Results
八十五只经历了本报告下腹主动脉阻断中描述的生存手术技术。总的生存率为85.9％。手术并发症包括肠道出血及大血管穿孔，导致5.9％和3.5％的死亡率分别为（ 见表1）。从麻醉中苏醒后，小鼠正常走路，且没有缺血性损伤的迹象下四肢。没有体重减轻或食欲不振指出。
继立体显微镜下剖腹探查术及腹膜后解剖无（A）和（B）主动脉阻断下腹主动脉图1A和1B显示图像。如图所示，它是对夹紧其全部主动脉宽度必须确保剥蚀沿着主动脉的宽度。我们的协议发现，使用急弯施瓦茨微塞尔以1.75毫米和“强”钳压的颚宽度细粒产生跨越具有最小钳位时间主动脉的整个宽度最大连续伤口。然而，其他夹具在具有可变损伤大小（ 图1C）几个阻塞的时间间隔进行了测试。结果呈现的其余均使用上述夹具制造。
主动脉的组织学评价证明了一起就证明了H＆E染色底层的平滑肌细胞层中度破坏内皮细胞衬里的完整的剥蚀。内皮剥蚀发生在两个10秒和10分钟，尽管程度不同（ 图2）。以确定用于完成动脉剥蚀所需的最佳主动脉阻断时间间隔，小鼠进行夹紧，持续10秒，1分钟和10分钟，如在上述方案中所述立即处死以供分析。该ARE随着钳定时（ 图3）一剥蚀的增加。在10秒，约为0.75 平方毫米的不完整和片状剥脱伤被确定由片状纤维蛋白原染色，其中纤维蛋白原充当剥蚀损伤的标志物。十几分钟主动脉阻断产生约为1.2mm 2完全裸露内皮地区，但这一数额的夹紧的时间被认为是肢体缺血再灌注损伤的高风险。因此，我们认为主动脉阻断充分，产生的平均剥蚀0.88 平方毫米面积的1分钟，导致几乎完全动脉剥脱伤无缺血性损伤的证据。
剥蚀损伤与主动脉阻断为1分钟的程度是非常可重复的，产生了600微米直径的剥蚀0.88 平方毫米面积（ 图3和4）。该纤维蛋白原染色的强度足以标识在稍后的时间点的原始损伤。 图4示出了经历了主动脉夹紧24小时，处死前1分钟，形成一个高度可再生伤三只小鼠的血纤维蛋白原染色。纤维蛋白原六个主动脉损伤后染色24小时的测量是大约0.81毫米2（ 图5A），在统计学上相似的0.88 平方毫米伤伤后立即注意到（p值= 0.14）。相比未受伤的内皮，伤后节目迁移内皮细胞覆盖纤维蛋白原染色，标记再内皮入剥蚀损伤（ 图5B）的伤口边缘24小时。平均0.88 平方毫米剥蚀损伤完整再内皮需要大约3天。但是，这种方法可以进一步适于产生甚至更大的剥蚀受伤。夹紧多次，每1分钟，从喙沿下腹主动脉尾产生3.7 mm 2的剥蚀伤害。虽然这种做法也损害了中膜，我们从来没有观察到腹主动脉夹层作为夹伤的结果。
这个协议表明腹主动脉阻断可以在用于创建动脉剥蚀损伤和测量内皮再生的目的鼠模型被安全地执行。
图1：隔离腹主动脉隔离腹主动脉无显示（A）和（B）血管钳。各种长度和夹具压强度的几个夹具被用来选择一个提供一致的损伤（℃）。施瓦茨麦克风RO Serrefine（箭头）所产生的最大的连续伤口。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：在非损伤小鼠（A）的腹主动脉段内膜剥脱 H＆E染色的效率和10秒（B）和主动脉阻断（C）10分钟后。血管夹紧完全滥伐内皮细胞层，如可通过没有细胞核染色进行验证。同时平滑肌细胞的细胞核损失显示了中膜损害。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：钳位时间的关系到伤口长度为10秒，1分钟和10分钟进行肾下腹部主动脉阻断。紧接损伤，被连接面的假手术和这些时间点，如图（A）和以更高的分辨率（B）中进行的免疫细胞化学。纤维蛋白原（紫色）标识损伤区。 β连环蛋白（红色）标识内皮边界。星号（*）标记的钳应用领域。 β-catenin的缺位表示缺乏损伤区血管内皮细胞。 （C）使用纤维蛋白原染色剥蚀损伤区域的一个标记，以表明，增加夹紧时间增加的剥蚀面积（n = 2的每个时间点）。误差线表示标准偏差。 请点击^ hERE查看此图的放大版本。
图4：以下进行1分钟主动脉阻断的损伤区 24小时辨识 ，主动脉解剖并切成露出内膜。在4％多聚甲醛固定后， 恩面对进行免疫。纤维蛋白原（紫色）标识损伤区 （A）。伤口边缘（B）和伤口（C）中显示的高倍。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：剥蚀的可重复性伤害和再内皮化的鉴定。二十四小时以下的损伤，主动脉解剖的规定并且接受了免疫恩面对 。利用纤维蛋白原作为剥蚀损伤的标志，一个高度重复性损伤是（A）和0.81 平方毫米的平均剥蚀区观察到的（N = 6）。更高分辨率的图像显示伤口边缘展品纤维蛋白原染色并与未受伤的内皮（C）的迁移的内皮细胞（箭头，紫染色）（B）中。误差线表示标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1：手术和术后死亡率共有85只小鼠的underw耳鼻喉科生存infrafrenal腹主动脉阻断与85.9％的存活率。 8只（9.4％）没有因肠出血或大血管穿孔生存手术。四只小鼠死于术后。
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Discussion
动脉损伤剥蚀，由于经皮干预措施，例如气囊血管成形术和血管支架，导致早期和晚期血管栓塞和再狭窄，并有助于复发性缺血事件3,12。有趣的是，外科血管夹紧也被牵连作为动脉剥蚀的原因，扩大的问题，以进行任何血管过程的患者的范围内，无论是经皮或打开13。而受损的再内皮化是血栓形成和再狭窄的相当认可的起因，周围再内皮化的分子机制已难以澄清。动物模型已成为必然获得以下动脉剥脱伤再内皮化的进一步的了解。
现有的动物模型来研究动脉剥蚀损伤的细胞和分子的影响包括那些在猪，兔和啮齿类动物7,9-11。鼠类MOD埃尔斯经常使用包括大鼠颈动脉球囊损伤模型，鼠标线损伤模型，大鼠和小鼠模型结扎14,15。虽然大鼠颈动脉球囊损伤模型是最好的特点和最常用的，由林德纳在小鼠中描述的颈动脉损伤的程序扩大了使用转基因品系16,17的可能性。转基因小鼠模型降低与药理学抑制剂相关的潜在的脱靶效应和特异性的问题的发生，并且可以允许对感兴趣的特定元素的组织特异性和有条件消融。尽管如此，在小鼠颈动脉损伤是极具挑战性和难以执行。
这里所描述的腹主动脉的鼠动脉剥蚀模型是比较容易实施，使体内的大口径动脉再内皮的研究。手术展出可接受河畔85.9％存活率率。卷绕长度是依赖于钳钳口尺寸，夹持压的强度和时间的血管钳闭塞该容器的长度。该模型采用的是10×1.75毫米颚尺寸和“强”钳压1分钟，以产生0.88 平方毫米剥蚀损伤是高度可重复的。在伤口长度的变化与不同的下巴的尺寸和血管闭塞的长度变化。此外，剥蚀的面积可以通过串联夹紧腹主动脉从延髓到尾扩展。因此，这种模式在可能被操纵，以适应一个人的研究旨在剥脱伤尺寸提供了多功能性。
评估的损伤后损伤和内皮闭合率程度，免疫细胞化学在不同时间点用抗β连环蛋白产生的抗体，以确定内皮细胞结或ERG识别内皮细胞核和纤维蛋白原识别吨进行他受伤部位。作为再内皮发生，纤维蛋白原染色用于识别相比于再内皮的程度原始损伤。而纤维蛋白原的强染色内皮的再生之后显著衰减，仍然存在甚至至少4天手术后经过足够的强度，以确定原来的伤害。
这个模型是不是没有限制。与任何动物模型，鼠手术需要良好的手术技术较难，导致一个学习曲线。小鼠可以迅速屈服于容器穿孔如果不小心，这有时是不可能控制进行清扫。手术死亡的最常见原因包括肠道出血及大血管穿孔，分别为5.9％和3.5％。然而，小心剥离，出血是罕见的失血通常可以保持在低于0.1毫升我们的经验。此外，主动脉和适当夹具的适当解剖位置是不可或缺的一个可再现的损伤。在检查远端主动脉搏动可以用于确认完成主动脉阻断，除去所有腹膜组织粘附到主动脉是用于获得一个干净的，不间断的伤口是至关重要的。如前面提到的，中膜损伤注意与主动脉阻断的此过程。然而，内侧平滑肌死亡是长期或慢性血管扩张由于支架植入术，并导致在随后的新内膜增生18的一个公知的后果。在我们的模型内侧的伤害不会出现有病理后遗症，因为我们没有术后死亡，这些小鼠存活长达2个月后。
我们提出下腹腹主动脉是可重复的良好存活率动脉剥脱伤的多功能小鼠模型。这种模式填补了需要研究动脉损伤的转基因小鼠模型中，众说纷纭。采纳OF该小鼠模型可用于阐明正常和病理条件下的再内皮的分子机制。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由从礼与再生医学的Edythe广泛中心补助和与健康（HL130290）的国家机构来支持MLIA加州大学洛杉矶分校训练计划干细胞研究，以ASS和AIM，菲利普·J.·惠特科姆奖学金到AIM。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Discovery.V12 Stereomicroscope | Zeiss | 495037-9904-000 | |
| Rodent Heated Surgical Platform | Protech International | RES4000 | Heated platform for body temperature maintenance with nosecone for anesthestic maintenance and on which surgical procedure is performed |
| Isoflurane | Henry Schein | 50033 | 4% Induction; 2.5% Maintenance |
| Isoflurane Vaporizer | Summit Medical Equipment | 470062 | |
| Stryker T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 17478-162-35 | |
| Carprieve (Carprofen) | Norbrook Laboratories | NDC 55529-131-01 | |
| Oster™ A5 Professional Animal Clipper | M.Schneider & Sons Inc. | 78005010 | Use with animal clipper size 40 |
| Adjustable Wire Retractor | Fine Science Tools | 17004-05 | |
| Schwartz Micro Serrefines - Sharp Bend | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| Surgical Instruments | Fine Science Tools | sharp dissecting forceps, blunt forceps, fine scissors, spring scissors, hemostat | |
| 0.5% Marcaine | Hospira | 0409-1610-50 | |
| 5-0 Suture, Vicryl | Fisher Scientific | NC0189890 | tapered needle |
| Vetbond | Fisher Scientific | NC0304169 | |
| Falcon® 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Dissecting pins | Fisher Scientific | NC9681411 |
References
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