Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein<em> In Vitro</em> Für die detaillierte Untersuchung von Neuron-Glia Interaktionen Set-up
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die indirekte Neuron-Astrozyten Co-Kultur für compartmentalized Analyse von Neuron-Glia Interaktionen.
Abstract
Proper neuronaler Entwicklung und Funktion ist die Voraussetzung der Entwicklungs- und adulten Gehirn. Jedoch sind die Mechanismen, die die stark kontrollierten Bildung und Aufrechterhaltung von komplexen neuronalen Netzwerken zugrunde liegenden nicht vollständig bisher verstanden. Die offenen Fragen Neuronen in Gesundheit und Krankheit betreffen , sind vielfältig und das Erreichen von Verständnis der grundlegenden Entwicklung der menschlichen Pathologien zu untersuchen, zum Beispiel Alzheimer-Krankheit und Schizophrenie. Die detaillierte Analyse der Neuronen in vitro durchgeführt werden. Allerdings Neuronen fordern Zellen und brauchen die zusätzliche Unterstützung von Astrozyten für ihre langfristige Überleben. Diese zelluläre Heterogenität in Konflikt mit dem Ziel, die Analyse von Neuronen und Astrozyten zu sezieren. Wir stellen Ihnen hier eine Zellkultur-Assay, der für die langfristige Co-Kultivierung von reinen primären Neuronen und Astrozyten, die die gleiche chemisch definierten Medium gemeinsam nutzen können, während er physisch zu seingetrennt. In diesem Aufbau überleben die Kulturen für bis zu vier Wochen, und der Test ist für eine Vielzahl von Untersuchungen über Neuron-Glia-Interaktion geeignet.
Introduction
In den vergangenen Jahrzehnten hat sich die allgemeine Interpretation von neuroglia Funktion aus der Zuschreibung eines nur unterstützend auf eine aktive regulatorische Rolle in Bezug auf neuronale Funktion 1 entwickelt. Aufgrund ihrer prominenten Auswirkungen auf Gehirn – Homöostase in Gesundheit und Krankheit 2, Astrozyten sind von besonderem Interesse für die wissenschaftliche Gemeinschaft. In den letzten Jahren haben auf Neuron-Glia – Wechselwirkung in vivo und in vitro 3 eine Vielfalt von Studien konzentriert. Doch die meisten der Kultursysteme nicht für die getrennte Analyse der beiden Zelltypen und ihrer jeweiligen secretomes ermöglichen.
Verschiedene Ansätze nutzen die direkte Co – Kultivierung von Neuronen und Glia 4-6 lang anhaltende Überleben und physiologisch relevanten neuronalen Netzwerk Entwicklung zu erreichen. Das vorliegende Protokoll erreicht die gleichen Ziele , während die beiden Zelltypen zu halten 7 physikalisch getrennt. Im Vergleich zu conditioned Medium nähert sich 8,9, unser System ermöglicht die bidirektionale Kommunikation zwischen Neuronen und Astrozyten zu studieren. Die Expression der sekretierten Signalmoleküle können überwacht werden, während die Zellen in dem gemeinsam genutzten Medium maturate. Diese Möglichkeit ist besonders relevant, da Astrozyten lösliche Faktoren freisetzen, wie beispielsweise Zytokinen, Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Matrixmoleküle 10,11, wodurch neuronal wachstumsregulierende und Funktion 7,12. Somit wurde gezeigt, dass die Zugabe an retinalen Ganglionzellen in vitro Thrombospondin die Bildung der Synapsen 13 induziert. Jedoch sind auch andere noch unbekannte Faktoren notwendig Synapsen zu machen funktionellen 13. Darüber hinaus haben freigesetzten Moleküle von Astrozyten, um identifiziert zu werden, um die Basis von Neuron-Glia Interaktionen zu verstehen.
Der Anbau von primären Neuronen und Astrozyten aus Maus und Ratte wurde zuvor 14-16 beschrieben. Hier sind wirpräsentieren ein elegantes und vielseitiges Werkzeug beide Zelltypen in einem indirekten Kokultur Ansatz zu kombinieren. Da die beiden Kulturen noch physikalisch getrennt werden, um die gleiche Medium teilen, um die Auswirkungen von Neuronen, Astrozyten und lösliche Moleküle können separat analysiert werden, wodurch ein leistungsfähiges Werkzeug für Neuron-Glia-Interaktionsstudien zu schaffen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Hauptziel des aktuellen Protokolls ist es, völlig getrennte neuronale und astrozytären Kulturen, während sie in gemeinsam genutzten Medium beibehalten wird. Aus diesem Grund erhalten die Reinheit der Kulturen sollten zu Beginn des Verfahrens überprüft werden. Wir empfehlen die Verwendung von Neuron-spezifischen Tubulin, neurofilaments oder NeuN Protein als neuronale Marker GFAP als astrozytären Marker, O4 Antigen als Oligodendrozyten Vorläufermarker und Iba1 Protein Mikroglia zu identifizieren.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 “Glia and Synapse”, Fa 159/11-1,2,3).
Materials
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-ß-D arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24 well plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro tube (2 ml) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 ml) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 ml) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
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