Yetişkin Fare Omurilik Doku İlköğretim Karışık glial Kültürler hazırlanması
Summary
nöropatik ağrı gelişimi omurilik glial hücrelerin patolojik değişiklikleri kapsar. Bu hücrelerin in vitro incelenmesi için, yetişkin omurilik dokusu elde edilir ve tasarlanmış güvenilir bir glial kültür sistemi yoksundur. Bu nedenle, biz yetişkin fare omurilik dokusu primer karışık glial kültürlerin nasıl kurulabileceğini burada gösteriyor.
Abstract
Omurilik glial tepkiler nöropatik ağrı gelişimine önemli ölçüde katkıda bulunduğunu çok iyi kabul edilmiştir. Hücresel ve moleküler seviyede glial faaliyetlerine ilişkin muazzam bilgiler, in vitro hücre kültür sistemleri ile elde edilmiştir. Kullanılan in vitro sistem, esas olarak neonatal beyin kortikal dokudan türetilen primer glia içerir ve hücre hatları ölümsüzleştirilmiş. Bununla birlikte, bu sistemler, in vivo olarak, spinal kord, glial hücrelerin özelliklerini yansıtmayabilir. Daha iyi in vivo durumunu yansıtan bir kültür sistemi kullanılarak periferik sinir hasarı-kaynaklı nöropatik ağrı gelişimi omurilik glial hücre rollerini araştırmak üzere, laboratuar primer omurilik karışık glial kültürleri oluşturulması için bir yöntem geliştirmiştir yetişkin fareler. Kısaca, omurilik, yetişkin farelerden toplandı ve dens olan miyelin uzaklaştırılarak elde edilmiş papain sindirim yoluyla işlenirSığ gradyanlı araç. Tek hücre süspansiyonları, 35.9 O ° C'de 2-merkaptoetanol (2-Me) ile desteklenmiş tam Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (cDMEM) kültürlenmiştir Bu kültür koşulları karışık glial hücrelerin büyümesi için özel olarak optimize edilmiştir. Bu koşullar altında, hücrelerin 12 ile deney için kullanılmak üzere hazır olan – 14 kültürde kurulması (D 0) sonra, (hücre, bu süre içinde log fazında genellikle) ve D 21 kadar kültür koşullarında muhafaza edilebilir. Bu kültür sistemi, çeşitli maddeler ve maddeler ile stimülasyonu ile omurilik glial hücre yanıtları araştırmak için kullanılabilir. Nöropatik ağrı Bunun yanı sıra, bu sistem, spinal kord, glial hücrelerin patolojik değişiklikler içeren diğer hastalıklarda glial yanıt incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Kronik ağrı kadar 635.000.000.000 $ 1 tahmini yıllık maliyeti, ABD'de yaklaşık 100 milyon yetişkin etkileyen ciddi bir sağlık sorunudur. Montaj kanıtlar nöropatik ağrı, kronik ağrı 2 en yıkıcı tür bir geliştirme omurilik glial hücrelerin önemli bir katkı göstermiştir. Uygun bir in vitro kültür sistemi ayrıca hücresel ve moleküler seviyede gliyal hücrelerinin rolleri araştırmak önemli ölçüde yardımcı olur.
Şu anda, araştırmacılar tarafından kullanılan in vitro glial kültür sistemleri yenidoğan fare veya sıçan beyinleri kortikal dokulardan elde edilen ağırlıklı glial hücreler içerir ve ölümsüzleştirdi neonatal fare türetilen glial hücre hatları veya primer glial hücreler sıçan. Yenidoğan hücreleri böylece sağlayan başka (özellikle astrositler ve mikroglia) glial hücrelere ayırt edilebilir farklılaşmamış hücreler önemli miktarda içerenDeneysel kullanım 3 bundant hücreleri. Bununla birlikte, daha önceki bir çalışma neonatal beyin gliyal hücreler, lipopolisakkarit (LPS) ile stimülasyon üzerine yetişkin omurilik, glial hücrelerinden önemli ölçüde farklı yanıt göstermiştir. Örneğin, interlökin (IL) -4 neonatal beyin glia 4 ile karşılaştırıldığında, yetişkin fare omurilik glia (NO) üretimi, LPS ile uyarılmış nitrik oksit önleyici etkilerini arttırdığını sergiledi. Bundan başka, gen-ilişkili peptid (CGRP) kalsitonin bir nöro-peptid ile stimülasyon üzerine kemokin üretiminin profilleri, (5. Referans açıklanan yöntemlere) yenidoğan fare beyin glia arasındaki tartışmasız farklıdır ve yetişkin fare omurilik glia (Şekil 1). Hücre serileri kullanımı ve bakımı kolay olan ve kısa bir süre içinde geniş hücre temin edebilmektedir. Genel olarak, hücre çizgileri oluşturulur ya da 6, 7 ya da aşağıdaki TH (örneğin yaygın olarak kullanılan mikroglial hücre hattı BV2 gibi) bir virüs aracılı ölümsüzleşme sistemi kullanan ölümsüzleştirilmişSpontan dönüşümün e tespiti (örneğin astrosit hücre hattı C8-D1A ve mikroglial hücre hattı C8-B4 gibi) 8, 9 Hücre hatları ayrı ayrı astrositler ve mikroglia moleküler özelliklerini okuyan mükemmel.; Ancak, hücre çizgilerinden elde edilen sonuçlar her zaman birincil hücrelerde veya in vivo koşullara de doğrulama gerektirir. Aynı zamanda, bir kemirgen omurilik glia türetilen bir glial hücre hattının bir rapor olmamıştır unutulmamalıdır.
Nöropatik ağrı, yetişkin sıçan karışık glial kültürler 4 üretmek için kullanılan daha önce bildirilen yöntem adapte tarafından geliştirilmiştir yetişkin fare omurilik türetilen bir kültür sisteminin geliştirilmesi, 5 omurilik glial hücre rolünü araştıran yardımcı olmak . fare omurilik glial kültürünü, en son 10 rafine edildi ve bu makalede daha detaylı olarak tarif edilmektedir. Yetişkin omurilik karışık glial kültürleri cBir özel çalışmada ihtiyaçlarına uygun seçilen türlerden bir fare ile kurulacak ve hücreler kültür başlatılmasını yayınlamak d fazla 21 için kültür içinde muhafaza edilebilir. Bu yöntem, hem de bu -associated amiyotrofik lateral skleroz (ALS), insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV), duyusal nöropati, ve birden fazla sıra omurilik içinde patolojik değişikliklerin dahil çeşitli nörolojik hastalıkların araştırmalarda, nöropatik ağrı çalışmalarında kullanılabilir skleroz (MS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüm adımları dahil deneyler arasında tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tutarlı bir şekilde programı değişen ortama gerçekleştirmek için çok önemlidir. Aşağıdaki adımlar mükemmel kalitede yetişkin karışık glia elde özellikle kritiktir.
enzimatik sindirim Bu protokolün önemli bir yönüdür. Doku parçaları, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için iyi sindirilir çok önemlidir. Bununla birlikte, aşırı sindirim önemli ölçüde daha az hücreleri n…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.
Materials
| Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5g/L glucose | Lonza | 12-709F | The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media. |
| L-Glutamine (100x) | Lonza | 17-605E | The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine. |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Corning-Mediatech | 30-004-CI | This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 µg/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component. |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | Sigma-Aldrich | M3148 | A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis. |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | Individual components of this kit can be purchased separately. |
| Percoll | GE Health Care | 17-0891-01 | Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed. |
| Lab-line incubator/shaker | Barstead/Lab-line | MaxQ4000 | This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead. |
| Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 | Sigma-Aldrich | L-9764 | Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary. |
| Mouse IL-6 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY406 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA | R&D Systems | DY410 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA | R&D Systems | DY466 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set | BD Biosciences | 555260 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse chemokine Q-Plex | Quansys Biosciences | 120251MS | This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis. |
| APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) | eBioscience | 17-0451 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 11-0112 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | BD Accuri C6 | Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers. |
| FlowJo software | Tree Star, Inc. | FlowJo7.6.5 | Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers. |
Riferimenti
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
- Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy?. Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).
- Ni, M., Aschner, M., Maines, M. D. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. Curr Protoc Toxicol. , (2010).
- Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects. J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).
- Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).
- Bocchini, V., et al. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).
- Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4. Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).
- Alliot, F. O., Pessac, B. Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella. Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).
- Malon, J. T., et al. Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells. J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).
- Cao, L., DeLeo, J. A. CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain. Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).
- Mayer, A. M., et al. Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia. BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscienze. 39 (1), 151-170 (1990).
- Rock, R. B., et al. Role of Microglia in Central Nervous System Infections. Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).
- Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).
