Kitle Histoloji nörodejenerasyon belirlememize<em> Drosophila</em
Summary
Drosophila yaygın nörodejenerasyonu incelemek için bir model sistem olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, beyinde vakuol oluşumu ile tespit edildiği üzere, sayısal edilebilir dejenerasyonu bir yöntemi tarif etmektedir. Aynı zamanda dolayı bir örnek olarak işleme ve kesit kontrol ve deney sinekler tarafından deneysel prosedüre etkileri en aza indirir.
Abstract
Alzheimer hastalığı (AH) veya Parkinson hastalığı (PH) gibi ilerici nörodejeneratif hastalıklar dünya çapında insan sağlığı için artan bir tehdit vardır. Memeli modeller patojenite altında yatan mekanizmaların önemli bilgiler vermiş olsa da, birlikte maliyeti yüksek olan memeli sistemlerin karmaşıklığı kullanımını sınırlayan. Bu nedenle, basit ama köklü Drosophila modeli sistemi bu hastalıklarda etkilenen moleküler yolları araştırmak için bir alternatif sunuyor. Davranış bozukluklarla birlikte, nörodejeneratif hastalıklar, nöron ölümü ve axonopathy Histolojik fenotip ile karakterize edilir. nöronal dejenerasyonu ölçmek için ve genetik ve çevresel faktörlerden nasıl etkilendiğini belirlemek için, erişkin sinek beyinlerinde vakuoller ölçme dayalı bir histolojik yaklaşım kullanın. sistematik hata etkilerini en aza indirmek için doğrudan kontrol ve exp bölümler karşılaştırmak içinbir hazırlık erimental sinekler, biz parafin kesitler için 'yaka' yöntemini kullanın. Nörodejenerasyon daha sonra uçucu beyin gelişmiştir vakuollerin boyutu ve / veya sayısı ölçülerek değerlendirilir. Bu da ilgi belirli bir bölgeye odaklanarak ya da tam kafa yayılan seri bölümleri alarak, tüm beyin analiz yapılabilir. Normal yaşlanma sırasında oluşur Bu nedenle, bu yöntem, bir ağır dejenerasyon değil, aynı zamanda bir kaç bölümlerde sadece saptanabilir nispeten hafif fenotipleri sadece ölçmek için sağlar.
Introduction
beklenen yaşam süresinin artmasıyla birlikte, Alzheimer veya Parkinson gibi nörodejeneratif hastalıklar genel nüfus için artan bir sağlık tehdidi haline gelmiştir. Ulusal Sağlık Enstitüleri göre, 115 milyon insan, dünya çapında, altta yatan önemli bir ilerleme birçoğu için, bu hastalıkların en azından bazı rol oynayan genleri ve risk faktörlerini tanımlamada yapılmış olmasına rağmen 2050 yılında bunama etkilenecek tahmin edilmektedir moleküler mekanizmalar hala bilinmeyen ya da iyi anlaşılmış bulunmaktadır.
Caenorhabditis elegans ve Drosophila melanogaster gibi basit omurgasız model organizma kısa bir yaşam döngüsü, döl çok sayıda ve köklü ve bazen de eşsiz genetik ve moleküler yöntemlerin 1 kullanılabilirliği de dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların mekanizmaları incelemek için deneysel avantajlar sunuyoruz -12. Ayrıca, bu organizmaların tarafsız mükellef bulunmaktadırnörodejeneratif fenotipleri üzerine ağırlaştırıcı veya iyileştirmede etkileri ile bu hastalıklara katkıda bulunan faktörleri belirleyebilir etkileşim ekranlar.
Böyle genetik etkileşimleri analiz ve yaşlanma etkilerini değerlendiren nörodejenerasyonu tespit etmek ve şiddetini ölçmek için nicel protokolleri gerektirir. Sayısal performans değeri 13-21 sağlamak gibi koku öğrenme, olumsuz geotaxis, ya da hızlı phototaxis olarak Drosophila davranış yönlerini, ölçerken Bu değerlendirme nispeten kolayca yapılabilir. Nöronlarının sayılması ile nöronal hayatta kalma etkileri belirlemek de mümkündür. PD etkilendiğini ve o zaman bile, sonuçları 22-24 tartışmalı olmuştur dopaminerjik nöronlar gibi, açıkça tanımlanabilir belirli bir nüfus odaklanarak Ancak, bu mümkündür.
Burada açıklanan protokol parafin seri bölümleri gerçekleştirmek için yaka yöntemini kullanan bir yöntemBu aslında Drosophila 25 anatomik beyin mutantlar tecrit etmek için kullanılan Heisenberg ve Böhl, tarafından geliştirilmiştir. Yaka yönteminin kullanımı, daha sonra cryosections, vibratome bölümleri, ve plastik bölümlerin 26-28 de dahil olmak üzere, adapte edilmiştir. Burada, bu yöntem, daha sonra nörodejeneratif fenotipleri 16,21,29-32 olan sinekler gelişen hücre arası boşluklar ölçmek için kullanılabilir, tüm uçucu kafası seri bölümleri elde etmek için kullanılır. Bu ölçümler belirli beyin bölgelerinde yapılabilir ya da tüm beyin kapağı olabilir; İkinci yaklaşım yaşlanma sırasında gözlemlediği gibi biri bile zayıf dejeneratif fenotipleri tanımlamak için izin verir. yaka kullanıldığında, son olarak, 20 sinekler olan bir preparasyon olarak işlenebilir, sadece daha az zaman alan, ancak, aynı zamanda hafif değişikliklere eserler minimize, kumanda aynı hazırlanmasında deney sinekler analiz sağlar hazırlık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tarif edilen yöntem, Drosophila beyinde nörodejenerasyonu ölçmek için bir araç sağlar. Belirli bir hücre tipi sayımı gibi diğer yöntemler, nörodejenerasyon tanımlamak için kullanılabilir, ancak bu yöntemin avantajı daha genel olarak uygulanabilir olmasıdır. hücrelerin sayılması bu hücrelerin güvenilir bir şekilde belirli bir antikor ya da her zaman mevcut değildir, bir hücreye özel markörün ekspresyonunu kullanarak tespit edilebilir olmasını gerektirir. Bundan başka, önemli ö…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants to D.K. from the Medical Research Foundation of Oregon and from NIH/NINDS (NS047663). E.S. was supported by a training grant from the NIH (T32AG023477).
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | |
| Collar | Genesee Scientific | TS 48-100 | We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A discription to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html |
| Rubber ice cube tray for embedding | Household store | The size can be made to fit by glueing in additional walls | |
| Crystallizing dish | Fisher Scientific company | 08-762-3 | |
| Ether | Fisher Scientific Company | E138-1 | |
| Ethanol | Decon Laboratories Inc. | 2701 | |
| Choloroform | Fisher Scientific Company | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific Company | A38-212 | |
| Methylbenzoate | Fisher Scientific Company | M205-500 | Distinct Odor |
| Use in fume hood | |||
| Low Melting Point Paraffin Wax | Fisher Scientific Company | T565 | Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath |
| Microtome | Leica Biosystems | Reichert Jung 2040 Autocut | |
| Microscope Slide | Fisher Scientific Company | 12-550D | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific Company | 12-545-M | |
| SafeClear | Fisher Scientific Company | 314-629 | Three different containers for washes |
| Vertical Staining Jar with Cover | Ted Pella Inc. | 432-1 | |
| Permount | Fisher Scientific Company | SP15-500 | |
| Poly-L-lysine Solution | Sigma Life Science | P8290-500 |
Riferimenti
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer’s disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet. 5, 279 (2014).
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).
- Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson’s disease, Alzheimer’s disease and autism spectrum disorder. Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).
- Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases. Chemistry Central Journal. 9, 65 (2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems. Hum Genet. 131, 535-563 (2012).
- Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila. Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).
- Konsolaki, M. Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila. Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).
- Kretzschmar, D. Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases. Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).
- Kretzschmar, D., et al. Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila. J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).
- Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).
- Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer’s disease. Mol Neurodegener. 8, (2013).
- Wentzell, J., Kretzschmar, D. Alzheimer’s disease and tauopathy studies in flies and worms. Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. , (2011).
- Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. J Vis Exp. , e50339 (2013).
- Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. , (2015).
- Iijima, K., et al. Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila. PLoS One. 3, e1703 (2008).
- Krishnan, N., et al. Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants. Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).
- Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila. Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).
- Ping, Y., et al. Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer’s model. PLoS Genet. 11, e1005025 (2015).
- Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants. PLoS One. 10, e0145356 (2015).
- Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson’s disease in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).
- Navarro, J. A., et al. Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson’s disease in Drosophila. J Neurochem. 131, 369-382 (2014).
- Heisenberg, M., Böhl, K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means. Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143 (1979).
- Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. The Drosophila brain revisited by enhancer detection. J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).
- Lin, C. W., et al. Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome. J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).
- Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes. Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).
- Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3. J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).
- Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila. Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).
- Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration. PLoS One. 7, e44440 (2012).
- Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
- Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER. Hereditas. 46, 635-650 (1960).
- Bettencourt da Cruz, A., et al. Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila. Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).
- Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).
- Davis, M. Y., et al. Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration. PLoS Genet. 12, e1005944 (2016).
- Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila. J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).
- Kretzschmar, D., et al. Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila. Glia. 49, 59-72 (2005).
- Li, Y., et al. A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).
