Mass Histologi at kvantificere neurodegeneration i<em> Drosophila</em

Summary

Drosophila er almindeligt anvendt som et modelsystem til at studere neurodegeneration. Denne protokol beskriver en metode, hvorved degenerering, som bestemt ved vacuole dannelse i hjernen, kan kvantificeres. Det minimerer også effekter som følge af den eksperimentelle procedure ved behandling og sektionering kontrol og eksperimentelle fluer som en prøve.

Abstract

Progressive neurodegenerative sygdomme som Alzheimers sygdom (AD) eller Parkinsons sygdom (PD) er en voksende trussel mod menneskers sundhed i hele verden. Selv pattedyr modeller har givet vigtig indsigt i de underliggende mekanismer af patogenicitet, er kompleksiteten af ​​pattedyr systemer sammen med deres høje omkostninger begrænser deres anvendelse. Derfor er den enkle, men veletablerede Drosophila model-system giver et alternativ til at undersøge de molekylære veje, der er berørt i disse sygdomme. Udover adfærdsmæssige afvigelser, er neurodegenerative sygdomme karakteriseret ved histologiske fænotyper såsom neuronal død og axonopathy. For at kvantificere neuronal degeneration og at bestemme, hvordan det påvirkes af genetiske og miljømæssige faktorer, bruger vi en histologisk tilgang, der er baseret på måling af vakuoler i voksne flyve hjerner. For at minimere virkningerne af systematisk fejl og til direkte at sammenligne sektioner fra kontrol- og experimental fluer i en forberedelse, bruger vi "krave" metode til paraffinsnit. Neurodegeneration vurderes derefter ved at måle størrelsen og / eller antallet af vakuoler, der har udviklet i gylp hjernen. Dette kan enten ske ved at fokusere på en bestemt region af interesse eller ved at analysere hele hjernen ved at opnå serielle snit, der spænder over fuldstændige hoved. Derfor er denne metode tillader en at måle ikke blot alvorlig degeneration, men også relativt milde fænotyper, der kun kan påvises i et par afsnit, som forekommer under normal aldring.

Introduction

Med stigningen i den forventede levetid, har neurodegenerative sygdomme som Alzheimers eller Parkinsons blevet et stigende sundhedstrussel for den almene befolkning. Ifølge National Institutes of Health, 115 millioner mennesker verden over forventes at blive påvirket af demens i 2050. Selv om der er gjort betydelige fremskridt med at identificere gener og risikofaktorer der er involveret i det mindste nogle af disse sygdomme, for mange af dem, den underliggende molekylære mekanismer er stadig ukendt eller ikke godt forstået.

Simple hvirvelløse modelorganismer som Caenorhabditis elegans og Drosophila melanogaster tilbyder en bred vifte af eksperimentelle fordele at studere mekanismerne i neurodegenerative sygdomme, herunder en kort livscyklus, stort antal afkom, og tilgængeligheden af veletablerede og til tider unikke genetiske og molekylære metoder ^{1 -12.} Desuden er disse organismer er modtagelige for fordomsfriinteraktion skærme, der kan identificere faktorer, der bidrager til disse sygdomme ved deres skærpende eller lindring af virkninger på neurodegenerative fænotyper.

Analyse sådanne genetiske interaktioner og vurdere aldrende effekter kræver kvantitative protokoller til at opdage neurodegeneration og måle dens sværhedsgrad. Denne vurdering kan gøres relativt let ved måling adfærdsmæssige aspekter i Drosophila, såsom olfaktoriske læring, negative geotaxis, eller hurtig phototaxis, som giver en numerisk ydeevne værdi ^13-21. Det er også muligt at bestemme virkningerne på neuronal overlevelse ved at tælle neuroner. Men dette er kun muligt, når der fokuseres på en bestemt befolkning, der er klart identificerbare, ligesom de dopaminerge neuroner, der er berørt i PD, og selv da, har resultaterne været kontroversielle ^22-24.

Protokollen beskrevet her anvender kraven metode til at udføre paraffin serielle snit, en fremgangsmådeder oprindeligt blev udviklet af Heisenberg og Böhl, der brugte det til at isolere anatomiske hjernen mutanter i Drosophila ^25. Brugen af kraven metode er efterfølgende blevet tilpasset, herunder kryosektioner, Vibratome sektioner, og plastprofiler ^26-28. Her er denne metode anvendes til opnåelse serielle sektioner af hele flue hoved, som derefter kan anvendes til at måle vakuolerne der udvikler sig i fluer med neurodegenerative fænotyper ^16,21,29-32. Disse målinger kan udføres på specifikke områder i hjernen eller kan dække hele hjernen; sidstnævnte tilgang tillader en at identificere selv svage degenerative fænotyper, som observeret under aldring. Endelig, når anvendelse af kraverne, op til 20 fluer kan behandles som én præparat, som ikke blot er mindre tidskrævende, men også giver mulighed for analyse af kontrol- og eksperimentelle fluer i det samme præparat, hvilket minimerer artefakter som følge af små ændringer i præparatet.

Protocol

1. Fastsættelse chefen på Kraver og Indlejring i Paraffin Bemærk: Alle trinene i fiksering processen bør ske i et stinkskab. Methylbenzoat, mens ikke udgør en sundhedsrisiko, har en højt udtalt lugt, som kan være overvældende, hvis ikke håndteres i et stinkskab. Før bedøve fluerne, udgør 50 ml Carnoy ved tilsætning 15 ml chloroform og 5 ml iseddike til 30 ml 99% ethanol (ikke blande chloroform og eddikesyre). Hæld det i en glasbeholder med en flad bund, såsom en crystalizing skålen, fo…

Representative Results

Under anvendelse af den beskrevne fremgangsmåde resulterer i serielle snit farvet af øjet pigment 33, der omfatter hele flue hoved. En del af dette er vist i figur 1B, hvor sektionerne fra en individuel hoved er vist fra top til bund. Sektionerne fra forskellige fluer ses venstre til højre i dette eksempel. For at lette orienteringen og identifikation af fluerne, er en eyeless flue (sinus oculis) indsættes som en markør ved position 3 (pil, <stro…

Discussion

Den beskrevne fremgangsmåde tilvejebringer et middel til at kvantificere neurodegeneration i hjernen hos Drosophila. Mens andre metoder, såsom at tælle en specifik celletype, kan anvendes til at identificere neurodegeneration, fordelen ved denne fremgangsmåde er, at den kan anvendes mere generelt. Tælle celler kræver, at disse celler kan identificeres pålideligt ved anvendelse af enten et specifikt antistof eller ekspressionen af ​​en cellespecifik markør, som ikke altid er til rådighed. Endvidere …

Materials

Name of the Reagent/Equipment	Company	Catalog Number
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A discription to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made to fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor
Use in fume hood
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome	Leica Biosystems	Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide	Fisher Scientific Company	12-550D
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific Company	12-545-M
SafeClear	Fisher Scientific Company	314-629	Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover	Ted Pella Inc.	432-1
Permount	Fisher Scientific Company	SP15-500
Poly-L-lysine Solution	Sigma Life Science	P8290-500