Mass Histologi å kvantifisere Nevrodegenerasjon i<em> Drosophila</em

Summary

Drosophila er mye brukt som modellsystem for å studere neurodegeneration. Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte ved hvilken degenerasjon, bestemt ved vakuole dannelse i hjernen, kan kvantifiseres. Det minimerer også effekter på grunn av den eksperimentelle prosedyren ved behandling og seksjonering kontroll og eksperimentelle fluer som en prøve.

Abstract

Progressive nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom (AD) eller Parkinsons sykdom (PD) er en økende trussel mot menneskers helse over hele verden. Selv pattedyr modeller har gitt viktig innsikt i de underliggende mekanismene for patogenitet, er kompleksiteten i pattedyrsystemer sammen med sine høye kostnader begrenser deres bruk. Derfor gir den enkle, men godt etablert Drosophila modell-system et alternativ for å undersøke molekylære stier som er berørt i disse sykdommene. Dessadferdsmessige mangler, er nevrodegenerative sykdommer kjennetegnet ved histologiske fenotyper som neuronal død og axonopathy. For å kvantifisere neuronal degenerasjon og for å bestemme hvordan den påvirkes av genetiske og miljømessige faktorer, bruker vi en histologisk tilnærming som er basert på måling av vakuoler i voksen flue hjerner. For å minimere effekten av systematisk feil og direkte sammenligne seksjoner fra kontroll og experimental fluer i en forberedelse, bruker vi "krage" -metoden for parafinsnitt. Neurodegenerasjon blir så vurdert ved å måle størrelsen og / eller antallet av vakuoler som har utviklet seg i fly hjernen. Dette kan enten gjøres ved å fokusere på et bestemt område av interesse eller ved å analysere hele hjernen ved å skaffe seriesnitt som strekker seg over hele hodet. Derfor gir denne metoden en til å måle ikke bare alvorlig degenerasjon, men også relativt milde fenotyper som kun er synlig i noen deler, som oppstår under normal aldring.

Introduction

Med økningen i levealder, har nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers eller Parkinsons blitt et økende helsetrussel for befolkningen generelt. Ifølge National Institutes of Health, 115 millioner mennesker over hele verden er spådd til å bli rammet av demens i 2050. Selv om betydelige fremskritt har blitt gjort for å identifisere gener og risikofaktorer som er involvert i det minste noen av disse sykdommene, for mange av dem, den underliggende molekylære mekanismer er fortsatt ukjent eller ikke godt forstått.

Enkle virvelløse modellorganismer som Caenorhabditis elegans og Drosophila melanogaster tilbyr en rekke eksperimentelle fordeler for å studere mekanismene for nevrodegenerative sykdommer, inkludert en kort livssyklus, stort antall avkom, og tilgjengeligheten av godt etablerte og noen ganger unike genetiske og molekylære metoder ^{1 -12.} Videre disse organismene er mottagelig for objektivinteraksjons skjermer som kan identifisere faktorer som bidrar til disse sykdommene ved sine skjerpende eller lindring effekter på nevrodegenerative fenotyper.

Analysere slike genetiske interaksjoner og vurdere aldringseffekter krever kvantitative protokoller for å oppdage nevrodegenerasjon og å måle alvorlighetsgrad. Denne vurderingen kan gjøres relativt enkelt når man måler atferdsmessige aspekter i Drosophila, for eksempel olfactory læring, negative geotaxis, eller rask phototaxis, som gir en numerisk ytelse verdi ^13-21. Det er også mulig å bestemme effektene på neuronal overlevelse ved å telle neuroner. Men dette er bare mulig når du fokuserer på en bestemt befolkning som er klart identifiserbar, som dopaminerge nevroner som er berørt i PD, og selv da, har resultatene vært kontroversiell ^22-24.

Protokollen er beskrevet her anvender kraven metode for å utføre parafinseriesnitt, en fremgangsmåtesom opprinnelig ble utviklet av Heisenberg og Böhl, som brukte den til å isolere anatomiske hjerne mutanter i Drosophila ^25. Bruken av kraven Metoden har senere blitt tilpasset, inkludert i frysesnitt, vibratome seksjoner, og plastseksjoner ^26-28. Her er denne metode som anvendes for å oppnå seriesnitt av hele fly hode, som deretter kan brukes til å måle vakuoler som utvikler seg i fluer med nevrodegenerative fenotyper ^16,21,29-32. Disse målingene kan gjøres i spesifikke hjerneområder, eller kan dekke hele hjernen; sistnevnte tilnærmingen gjør det mulig å identifisere selv svake degenerative fenotyper, som observert under aldring. Til slutt, ved bruk av kragene, opp til 20 fluer kan behandles som en forberedelse, som ikke bare er mindre tidkrevende, men også gir mulighet for analyse av kontroll og eksperimentelle flyr i det samme preparat, noe som minsker artefakter som følge av små endringer i fremstillingen.

Protocol

1. Fikse hodet på krage og bygge inn i Parafin Merk: Alle trinnene i fiksering prosessen bør gjøres i en avtrekkshette. Metylbenzoat, mens ikke utgjør en helserisiko, har en svært distinkt lukt, som kan være overveldende hvis ikke håndteres på en avtrekkshette. Før bedøvelse fluene, utgjør 50 ml Carnoy oppløsning ved tilsetning av 15 ml kloroform og 5 ml iseddik til 30 ml av 99% etanol (ikke blande kloroform og eddiksyre). Helle det i en glassbeholder med en flat bunn, slik som en crystali…

Representative Results

Ved hjelp av de beskrevne metode resulterer i seriesnitt farget med det blotte øye pigment 33 som omfatter hele fluehodet. En del av dette er vist i figur 1 B, hvor seksjonene fra en individuell leder er vist fra topp til bunn. Seksjonene fra forskjellige fluer er sett fra venstre til høyre i dette eksempelet. For å lette orientering og identifisering av fluer, er en eyeless fly (sinus oculis) satt inn som en markør i posisjon 3 (pil, figu…

Discussion

Den beskrevne fremgangsmåten tilveiebringer et middel for å kvantifisere neurodegenerasjon i hjernen hos Drosophila. Mens andre metoder, som teller et bestemt celletype, kan benyttes til å identifisere nevrodegenerasjon, er fordelen med denne metoden er at den kan anvendes mer generelt. Telle celler krever at disse cellene kan bli pålitelig identifiseres ved hjelp av enten et spesifikt antistoff eller ekspresjonen av en celle-spesifikk markør, noe som ikke alltid er tilgjengelig. Videre har det blitt vist …

Materials

Name of the Reagent/Equipment	Company	Catalog Number
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A discription to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made to fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor
Use in fume hood
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome	Leica Biosystems	Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide	Fisher Scientific Company	12-550D
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific Company	12-545-M
SafeClear	Fisher Scientific Company	314-629	Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover	Ted Pella Inc.	432-1
Permount	Fisher Scientific Company	SP15-500
Poly-L-lysine Solution	Sigma Life Science	P8290-500