히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em> C. 엘레</em
Summary
유전자 인코딩 히스톤 – miniSOG는 푸른 빛 의존적으로 게놈 전체의 유전 변이를 유도한다. 이 돌연변이 유발 방법은 빠르고 간단 독성 화학 물질의 자유, 앞으로 유전자 검사 및 유전자 통합에 적합합니다.
Abstract
Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.
Introduction
앞으로 유전 화면이 널리 예쁜 꼬마 선충 (C. elegans의) 1과 모델 생물의 다양한 생물학적 과정을 방해 유전 적 돌연변이를 생성하는 데 사용되었다. 이러한 돌연변이의 분석은 기능적으로 중요한 유전자의 발견을 유도 및 시그널링 1,2 경로. 전통적으로, C.에서 돌연변이 유발 엘레은 돌연변이 유발 화학 물질, 방사선, 또는 트랜스포존 2를 사용하여 달성된다. 에틸 메탄 (EMS) 및 N – 에틸 N의 -nitrosourea (ENU) 인간에게 독성이 같은 화학; 감마선 또는 자외선 (UV) 방사선 돌연변이 특별한 장비를 필요로; 및 뮤 테이터 균주 3 등 트랜스포존 활성 균주, 유지 보수시 불필요한 돌연변이를 일으킬 수 있습니다. 우리는 유 전적으로 인코딩 된 감광제 (4)를 이용하여 유전 변이를 유도하는 간단한 방법을 개발했습니다.
반응성 산소 종 (ROS)의 DNA 5가 손상 될 수 있습니다.미니 중항 산소 발생기 (miniSOG)는 LOV (빛, 산소 및 전압)에서 설계 한 106 아미노산 애기 phototropin 2/6 도메인의 녹색 형광 단백질이다. 청색광 (~ 450 ㎚), miniSOG에 노출시 ROS는 모든 세포에 존재하는 보조 인자 6-8로 FL AVIN 모노 뉴클레오티드와 일 중항 산소를 포함한 생성한다. 우리는 히스톤-(72), C의 C 말단에 miniSOG에 태그를 지정하여 그의-mSOG 융합 단백질을 구성 히스톤 (3)의 엘레 변형 우리는 C.의 생식 세포에 그의-mSOG을 표현하는 단일 복사 유전자 (9)을 생성 엘레. 어둠 속에서 정상 배양 조건은 그의-mSOG 유전자 변형 웜은 정상 무리의 크기와 수명 4 있습니다. 블루 LED 빛에 노출되면, 그의-mSOG 웜은 자신의 자손 4 사이의 유전 변이를 생산하고 있습니다. T에 C : A와 G : C에 C : G, 작은 chromoso에 의한 돌연변이의 스펙트럼은 G와 같은 염기 변화를 포함날 4 삭제. 이 돌연변이 유발 절차를 수행하는 간단하고, 최소한의 실험 안전 설정을 요구한다. 여기, 우리는 optogenetic 돌연변이 유발을위한 LED 조명 설정 및 절차에 대해 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서는 optogenetic 돌연변이의 상세한 절차는 그의-mSOG는 배아에서 발현 이용하여 소규모 순방향 유전 화면의 일례를 설명 제공. 표준 화학적 돌연변이 유발에 비해,이 optogenetic 돌연변이 유발 방법은 여러 가지 장점을 갖는다. 첫째, 이에 거리와 같은 EMS, ENU 같은 독성 화학 돌연변이에서 실험실 인력을 유지하고 자외선 (TMP / UV)와 trimethylpsoralen, 무독성이다. 둘째, 돌연변이 유발 실험 절차는 P …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.
Materials
| Ultra High Power LED light source | Prizmatix | UHP-mic-LED-460 | 460 ± 5 nm |
| LED controller | Prizmatix | UHPLCC-01 | |
| Digital function generator/amplifier | PASCO | PI-9587C | PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127. |
| BNC cable male/male | THORLABS | CA3136 | |
| USB-TTL interface | Prizmatix | Optional | |
| Photometer | THORLABS | PM50 and Model D10MM | |
| Filter paper | Whatman | 1001-110 | |
| Copper chloride dihydrate (CuCl2∙2H2O) | Sigma | C6641 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ95 | |
| NGM plate | Dissolve 5g NaCl, 2.5g Peptone, 20g Agar, 10 µg/ml cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH6.0). | ||
| Lysis solution | 10 mM Tris(pH8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/ml Proteinase K |
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