Endothelial सेल माइटोकॉन्ड्रिया रक्त मस्तिष्क बाधा अखंडता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं। हम मस्तिष्क संवहनी endothelial कोशिकाओं में bioenergetic समारोह को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का परिचय।
रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) की अखंडता मस्तिष्क की चोट को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। सेरेब्रल संवहनी endothelial (CVE) कोशिकाओं सेल प्रकार है कि BBB समावेश में से एक हैं; इन कोशिकाओं को एक बहुत ही उच्च ऊर्जा की मांग है, जो इष्टतम mitochondrial समारोह की आवश्यकता है। बीमारी या चोट के मामले में, इन कोशिकाओं में mitochondrial समारोह, बदला जा सकता है रोग या BBB के उद्घाटन में जिसके परिणामस्वरूप। इस पांडुलिपि में, हम पूरे बरकरार कोशिकाओं और एक bioanalyzer का उपयोग करके CVE कोशिकाओं में mitochondrial समारोह को मापने के लिए एक विधि का परिचय। एक Mito-तनाव परख कोशिकाओं है कि, परेशान कर दिया गया है या तो शारीरिक या रासायनिक चुनौती है, और उनकी bioenergetic समारोह का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। साथ ही, इस विधि को भी नई चिकित्सा विज्ञान mitochondrial समारोह पर प्रत्यक्ष प्रभाव है कि स्क्रीन के लिए एक उपयोगी तरीका प्रदान करता है। हम सेल घनत्व ऑक्सीजन की खपत की दर है कि mitochondrial पैरा की एक किस्म की गणना के लिए अनुमति देते हैं उपज के लिए आवश्यक अनुकूलित हैमीटर, एटीपी उत्पादन, अधिक से अधिक श्वसन, और अतिरिक्त क्षमता भी शामिल है। हम यह भी प्रदर्शित किया कि microRNA, मीर 34a की शुरूआत, mitochondrial गतिविधि में एक स्पष्ट और पहचाने जाने कमी की ओर जाता द्वारा परख की संवेदनशीलता दिखाने के लिए। इस पत्र में दिखाया गया डेटा bEnd.3 सेल लाइन के लिए अनुकूलित है, हम भी प्राथमिक CVE कोशिकाओं के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलित किया है, आगे preclinical और नैदानिक मॉडल में उपयोगिता का सुझाव दे।
यह व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है कि रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) मस्तिष्क संवहनी endothelial (CVE) कोशिकाओं द्वारा गठित संवहनी जीव विज्ञान के लिए सर्वोपरि बहुत ही अलग और अनूठा कार्य किया है। ये endothelial कोशिकाओं माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग करें (एटीपी) adenosine triphosphate के सेलुलर आपूर्ति का सबसे उत्पन्न करने के लिए रासायनिक ऊर्जा के स्रोत के रूप में। CVE कोशिकाओं के लिए एटीपी प्रदान करने के अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया 1-4 संकेत ऐसे सेलुलर के रूप में संवहनी endothelial कोशिकाओं में विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं, apoptosis 5, और सेल चक्र का नियंत्रण है और सेल के विकास को 6। CVE कोशिकाओं में mitochondrial bioenergetic समारोह का अनियंत्रण को विनियमित mitochondrial biogenesis प्रभावित कर सकता है, बिगड़ा संवहनी endothelium गतिविधि के लिए अग्रणी है, और cerebrovascular रोग और neurodegenerative विकारों, जैसे, स्ट्रोक 7.8 और अल्जाइमर रोग (ई) 9 बढ़ा सकते हैं। हम जानते हैं कि CVE कोशिकाओं को अपमान निम्नलिखित lipopolysac के लिए जोखिम का प्रदर्शन किया हैcharide (LPS) CVE कोशिकाओं में mitochondrial समारोह ख़राब और खराब हो स्ट्रोक परिणामों 7। Tert-Butylhydroquinone (TBHQ) CVE कोशिकाओं 10 में आक्सीकारक फास्फारिलीकरण के साथ हस्तक्षेप से स्ट्रोक मृत्यु दर बढ़ जाती है। इसलिए, CVE कोशिकाओं न केवल पायलटों केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए तंत्र से संबंधित अध्ययन की एक श्रृंखला (सीएनएस) रोगों में bioenergetic समारोह के मात्रात्मक मॉडल, लेकिन यह भी संवहनी जीव विज्ञान में mitochondrial समारोह को लक्षित चिकित्सा विज्ञान की दवा स्क्रीनिंग में एक सफलता है।
पृथक माइटोकॉन्ड्रिया bioenergetic समारोह को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हम 7 और दूसरों 11 एक बाह्य प्रवाह bioanalyzer का उपयोग करके बरकरार CVE कोशिकाओं में सेलुलर बायोइनरजेटिक्स के आकलन की सूचना है। विश्लेषक अंतर्जात सेलुलर bioenergetic आकलन का लाभ प्रदान करता है। यह संवेदनशील है और लगातार परख CVE कोशिकाओं के mitochondrial चयापचय उपायों और एसटीआई द्वारा bioenergetic हानि का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैमूली, mitochondrial संकेत दे रास्ते के तंत्र, और स्क्रीन दवाओं या उपचार है कि CVE कोशिकाओं में mitochondrial समारोह को प्रभावित जाँच। ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) bioanalyzer चार mitochondrial disruptors के उपयोग के संयोजन के द्वारा एक औषधीय प्रोफाइलिंग दृष्टिकोण का उपयोग करके दर्ज की गई है: Oligomycin, कार्बोनिल साइनाइड -4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), rotenone, और antimycin ए इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से एक अनुकूलित दृष्टिकोण है कि एक भी परख में, माप और CVE कोशिकाओं में mitochondrial कार्यात्मक मापदंडों, बेसल mitochondrial श्वसन, एटीपी उत्पादन, प्रोटॉन रिसाव, अधिक से अधिक श्वसन, और स्पेयर सांस की क्षमता सहित की गणना के लिए अनुमति देता है।
इस प्रोटोकॉल मस्तिष्क संवहनी endothelial कोशिकाओं में bioenergetic phenotype के मूल्यांकन के लिए एक विधि का प्रतिनिधित्व करता है। यह endothelial सेल mitochondrial मूल्यांकन के लिए एक बुनियादी परख के रूप में कार्य करता है, और यह उत्तेजनाओं के तंत्र कि CVE कोशिकाओं में mitochondrial संकेतन मार्ग प्रभावित कर सकता है की जांच करने के लिए डिजाइन प्रयोगों के लिए इष्टतम है। यह भी बीबीबी-व्यवधान से जुड़े रोगों के लिए संभावित चिकित्सा परीक्षण के लिए एक तरीका प्रदान करता है।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
बाह्य प्रवाह bioanalyzers वास्तविक समय में ओसीआर उपाय करने की क्षमता है। इस परख में, उचित सेल घनत्व की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है। सेल घनत्व प्रति अच्छी तरह से 8 × 10 3 कोशिकाओं से नीचे है, बेसल ओसीआर बहुत कम विश्लेषण किया जा करने के लिए (2 चित्रा और चित्रा 3) है; अगर सेल घनत्व के ऊपर अच्छी तरह से प्रति 32 × 10 3 कोशिकाओं है, कोशिकाओं oligomycin या FCCP treatme का जवाब नहीं हैएनटीएस (चित्रा 2 और चित्रा 3)। हमारे प्रयोगात्मक मॉडल में इस सेल लाइन के लिए इष्टतम सेल घनत्व में अच्छी तरह से है, जो दोहराया परिणाम और संवेदनशीलता को दर्शाता है 7 और उपचार 10,14 उत्तेजनाओं को प्रति 16 × 10 3 कोशिकाओं है। 24 अच्छी तरह से bioanalyzer प्रयोग किया जाता है, तो सेल घनत्व के नए अनुमापन परख के लिए आवश्यक होगा।
कि CVEs अन्य endothelial कोशिकाओं या प्रकार के ऊतकों 15,16 के साथ तुलना में माइटोकॉन्ड्रिया की एक बड़ी मात्रा है यह दस्तावेज है, अधिक से अधिक ऊर्जा उत्पादन और बायोइनरजेटिक्स चयापचय को मापने के लिए कम कोशिकाओं के लिए जरूरत का सुझाव दे। हम इस तरह के प्राथमिक के रूप में मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के कई प्रकार के परीक्षण किया और murine cerebrovascular endothelial कोशिकाओं 7 अमर और मानव cerebrovascular endothelial कोशिकाओं (अप्रकाशित डेटा) अमर कर दिया है। इन कोशिकाओं को समान सेल घनत्व के लिए आवश्यक 40 के भीतर स्वीकार्य ओसीआर (बेसल श्वसन ओसीआर तक पहुंचने के लिए – के लिए 160 pmol / मिनट96 अच्छी तरह प्लेटें और 50 – 400 से pmol / 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए न्यूनतम) जब बायोइनरजेटिक्स परख प्रदर्शन किया गया था। Kaczara एट अल। मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC) है, जो एक उच्च सेल घनत्व 17 इस्तेमाल में bioenergetic चयापचय को मापने की सूचना दी।
हमारे समूह के अन्य ऊतकों या अंगों से पोत कोशिकाओं का मूल्यांकन नहीं किया। सैद्धांतिक रूप से, bioanalyzer संभावित किसी भी कोशिका प्रकार पर इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह सेल घनत्व, सेल संस्कृति के माध्यम से, और संस्कृति की स्थिति (कुछ विशिष्ट कोशिकाओं में लिपटे प्लेटों आवश्यकता हो सकती है अच्छी तरह से विकसित करने के लिए) के लिए परख के अनुकूलन की आवश्यकता है। यह आवश्यक है कि प्रयोगों सुनिश्चित करने के लिए ओसीआर दर स्वीकार्य सीमा के भीतर है पूरा कर रहे है। अन्य अंगों से endothelial कोशिकाओं में ओसीआर दिमाग से CVEs की तुलना में कम है, तो सेल घनत्व में वृद्धि के लिए एक स्वीकार्य ओसीआर सीमा के भीतर प्राप्त करने में मदद कर सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को ऊर्जा के मुख्य स्रोत के रूप आक्सीकारक फास्फारिलीकरण उपयोग नहीं कर रहे हैं, तो bioanalyzer नहीं एक ऑप्टिमा होगाएल परख।
bioanalyzer जिस क्रम में अभिकर्मकों लागू कर रहे हैं पर आधारित है, इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के अनुक्रमिक विघटन के लिए अनुमति देता है। सबसे पहले, oligomycin लागू किया जाता है, जो mitochondrial परिसर वी (एटीपी synthase) को रोकता है। दूसरा, FCCP, एक इलेक्ट्रॉन uncoupler, लागू किया जाता है, जो प्रोटॉन ढाल के विघटन की ओर जाता है। अंत में, rotenone और antimycin ए, जो mitochondrial परिसर मैं और तृतीय रोकना, क्रमशः, इलेक्ट्रॉन प्रवाह की कुल निषेध करने के लिए नेतृत्व करने के लिए लागू कर रहे हैं। दवा जोखिम के क्रम में आवश्यक है क्योंकि दवाओं विशिष्ट इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला प्रतिक्रिया खंड है, और क्रमिक परिवर्तन mitochondrial समारोह को प्रतिबिंबित करने के लिए मापा जा सकता है।
संशोधन और समस्या निवारण
mitochondrial प्रतिक्रिया CVE कोशिकाओं में उत्तेजनाओं का मूल्यांकन करने के लिए, यह सिफारिश की है के बाद कोशिकाओं सेल कल्चर प्लेट नीचे का पालन कर रहे है कि उत्तेजनाओं कोशिकाओं को लागू कर रहे हैं (समय देखनाचित्रा 1 में दिखाया गया है; यह आम तौर पर कम से कम 6 घंटे लगते हैं)। उपचार से दोहराया परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह सेल घनत्व अनुरूप रखने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। pretreatments सेल बोने के लिए पहले तैयार कर रहे हैं, तो प्रत्येक पूर्व उपचार के लिए सेल घनत्व को ध्यान से मापा जाना चाहिए, बोने के लिए मृत कोशिकाओं को छोड़कर। अभिकर्मक प्रयोगात्मक डिजाइन में शामिल है, तो निर्माता के अभिकर्मक प्रोटोकॉल को देखें। चित्रा 4 में प्रस्तुत डाटा में प्रदर्शन किया, मीर 34a एक lipofectamine अभिकर्मक किट है, जो मीर 34a की overexpression के साथ चयापचय समारोह में परिवर्तन का आकलन करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं से मुक्त सेल संस्कृति के माध्यम से और एक Mito-तनाव परीक्षण की आवश्यकता का उपयोग कर CVE कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट गया था । प्लाज्मिड की खुराक भी अनुकूलित किया जा सकता है, जैसा कि पहले 13 प्रकाशित किया। एक और बदलाव है कि प्रोटोकॉल के लिए बनाया जा सकता है अभिकर्मकों की सांद्रता बदल रहा है। Oligomycin, FCCP, और / या rotenone और Antimycin ए के एक अनुमापन वक्र comple हो सकता हैटेड।
इसके अलावा, इस परख उच्च throughput के लिए प्रयोग किया जाता है विभिन्न दवाओं का विश्लेषण करती है, तो यह एक समानांतर परख सेल व्यवहार्यता और सेल प्रसार, जो हमारे पिछले प्रकाशनों 7,13 में वर्णित किया गया मापने के लिए शामिल करने के लिए सुझाव दिया है। ओसीआर मूल्यों में काफी सेल नंबर (आंकड़े 2 और 3) से प्रभावित हैं, और सेल प्रसार और व्यवहार्यता assays के डेटा को सामान्य बनाने को फायदा होगा। हालांकि, इन assays के पूरा होने के लिए प्रत्येक व्यक्ति प्रयोगशाला के विवेक पर है।
तकनीक की सीमाएं
इस प्रोटोकॉल के प्रमुख सीमा है कि हम केवल अध्ययन में इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल का इस्तेमाल किया है। वर्तमान में, वहाँ कोई कमरा पूर्व vivo मॉडल या पशु मॉडल है कि endothelial सेल mitochondrial समारोह को संबोधित कर सकते हैं। नयी मॉडल विवो में bioenergetic समारोह के मूल्यांकन के लिए विकसित किए जाने की उम्मीद कर रहे हैं और <eM> पूर्व भविष्य के अध्ययनों में विवो।
एक और सीमा बायोइनरजेटिक्स उपायों का पालन बाधा आकलन का विस्तार है। प्रयोगों, क्योंकि पहले, bioenergetic माप के पूरा होने के बाद, सेल व्यवहार्यता इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला का पूरा विघटन के बाद कम हो जाता है नहीं किया जा सकता है; दूसरा, विशेष सेल संस्कृति प्लेटों और सम्मिलित बायोइनरजेटिक्स मूल्यों का पता लगाने के लिए आवश्यक हैं और बाधा आकलन के लिए सम्मिलित फिट नहीं है। इसलिए, वहाँ कई कार्यात्मक assays कि बायोइनरजेटिक्स परख के बाद पूरा किया जा सकता नहीं कर रहे हैं। हालांकि, यह उम्मीद है कि विशेष उपकरणों बायोइनरजेटिक्स परख करने से पहले कार्यात्मक assays प्रदर्शन करने के लिए विकसित किया जा सकता है।
मौजूदा / वैकल्पिक तरीके के लिए सम्मान के साथ तकनीक का महत्व
Mitochondrial समारोह का मूल्यांकन करने के लिए पिछले तकनीकों कोशिकाओं 18 से माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव जरूरी हो। इस nebioanalyzer का उपयोग कर डब्ल्यू तकनीक बरकरार कोशिकाओं में mitochondrial गतिविधि है, जो अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया के मूल्यांकन की तुलना में सेलुलर पर्यावरण के अधिक बरकरार रखता है की माप के लिए अनुमति देता है।
भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश इस तकनीक माहिर के बाद
इस प्रोटोकॉल बनाया गया है और bEnd.3 सेल लाइन के लिए विकसित की है, लेकिन यह भी प्राथमिक मस्तिष्क संवहनी endothelial (pCVE) कोशिकाओं 7 या अन्य endothelium के साथ संगत है, और हम हमारे पिछले प्रकाशन pCVE कोशिकाओं 7 का उपयोग कर में इस प्रदर्शन किया है। जब endothelium के अन्य प्रकार उपयोग किया जाता है, संस्कृति की थाली की कोटिंग और वृद्धि कारकों के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है। हालांकि, अनुमापन परख के रूप में अच्छी तरह से अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए सिफारिश की है। इस प्रोटोकॉल एक सामान्य विधि CVE कोशिकाओं के बायोइनरजेटिक्स के मूल्यांकन में अपनाई जाने वाली प्रदान करता है, और इसे आगे तंत्र के अध्ययन या इस तरह से चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं को लागू किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the following grants: AHA 16SDG31170008 to X.R. and NIH P20 GM109098, P01 AG027956, and U54 GM104942 to J.W.S.
bEnd.3 cell line | ATCC | CRL-2299 | 25-30 passages |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S12450 | 10% in final |
Penicillin/Steptomycin | Hyclone | SV30010 | 1×100 stocking |
0.25% trypsin 0.03% EDTA solution | Corning | 25-053-CI | |
Sodium pyruvate | Corning | 25-000-CI | 1.0 µM in final |
Glucose | Sigma | CAS 50-99-7 | 25 mM in final |
Oligomycin | Sigma | O4876 | 1.0 µM in final |
Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | 0.5 µM in final |
Rotenone | Sigma | R8875 | 1.0 µM in final |
Antimycin A | Sigma | CAS 1397-94-0 | 1.0 µM in final |
Plate wash station | Seahorse Bioscience | ||
Extracellular flux bioanayzer | Seahorse Bioscience | XFe96 | |
Extracellular flux cell culture plate | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
Extracellular flux sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
Extracellular flux calibrant solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
Extracellular flux assay medium | Seahorse Bioscience | 102365-100 | PH buffered prior to assay |