mitocôndrias de células endoteliais são fundamentais para manter a integridade do cérebro-barreira sangue. Nós introduzimos um protocolo para medir a função bioenergética em células endoteliais vasculares cerebrais.
A integridade do sangue-cérebro-barreira (BBB) é crítico para evitar a lesão cerebral. endotelial vascular cerebral células (CVE) são um dos tipos de células que compõem o BBB; estas células têm uma procura muito alta energia, o que requer a função mitocondrial óptima. No caso de doença ou lesão, a função mitocondrial nestas células pode ser alterada, resultando em doença ou a abertura da BBB. Neste artigo, apresentamos um método para medir a função mitocondrial em células CVE usando células intactas, inteiras e um Bioanalyzer. Um ensaio de mito-stress é usada para desafiar as células que foram perturbadas, física ou quimicamente, e avaliar a sua função bioenergética. Além disso, este método também fornece uma maneira útil para rastrear novas terapêuticas que têm efeitos diretos sobre a função mitocondrial. Temos optimizada a densidade celular necessária para se obter as taxas de consumo de oxigénio que permitem o cálculo de uma variedade de para mitocondrialmetros, incluindo a produção de ATP, a respiração máxima e capacidade de reposição. Também mostram a sensibilidade do ensaio, demonstrando que a introdução da microRNA, miR-34a, conduz a uma diminuição pronunciada e detectável da actividade mitocondrial. Embora os dados apresentados neste documento é optimizado para a linha celular bEnd.3, temos também optimizada do protocolo para as células ECV primárias, sugerindo ainda mais a utilidade em modelos pré-clínicos e clínicos.
É amplamente reconhecido que o sangue-cérebro-barreira (BBB), formada por células endoteliais vasculares cerebrais (AVC) tem funções muito distintas e únicas primordiais para a biologia vascular. Estas células endoteliais usar mitocôndrias para gerar a maior parte do fornecimento celular de trifosfato de adenosina (ATP) como fonte de energia química. Além de fornecer ATP para as células ECV, mitocôndrias regulação de diversos processos celulares em células endoteliais vasculares, tais como sinalização celular, apoptose 1-4 5, e o controlo do ciclo celular e crescimento celular 6. A desregulação da função bioenergética mitocondrial em células ECV podem afectar a biogénese mitocondrial, levando a actividade de endotélio vascular danificado, e exacerbar doenças cerebrovasculares e desordens neurodegenerativas, por exemplo, acidente vascular cerebral 7,8 e doença de Alzheimer (AD) 9. Nós demonstramos que as células ECV insultos a seguir a exposição a lipopolysaccharide (LPS) prejudicar a função mitocondrial em células CVE e piorar acidente vascular cerebral resultados 7. Terc-butil-hidroquinona (tBHQ) aumenta mortalidade por AVC, interferindo com a fosforilação oxidativa em células CVE 10. Portanto, o modelo quantitativo da função bioenergética em células CVE não só pilotos uma série de estudos relacionados com o mecanismo de sistema nervoso central (SNC) doenças, mas também fornece um avanço na triagem de drogas de terapias dirigidas a função mitocondrial em biologia vascular.
Mitocôndrias isoladas têm sido usados para medir a função bioenergética. Nós 7 e outros 11 têm relatado avaliações da bioenergética celular em células intactas CVE usando um Bioanalyzer fluxo extracelular. O analisador proporciona a vantagem da avaliação do bioenergética celular endógeno. Este ensaio sensível e consistente mede o metabolismo mitocondrial de células ECV e pode ser utilizado para avaliar deficiência bioenergética por STImuli, investigar os mecanismos de vias de sinalização mitocondrial, e drogas de tela ou tratamentos que afetam a função mitocondrial em células CVE. A Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) é registrado pela Bioanalyzer usando uma abordagem de perfil farmacológico, combinando o uso de quatro disruptores mitocondriais: oligomicina, carbonil cianeto-4 (trifluorometoxi) fenil-hidrazona (FCCP), rotenona, e antimicina A. Neste protocolo, detalhamos uma abordagem otimizada que permite a medição e cálculo dos parâmetros funcionais mitocondriais em células CVE, incluindo respiração basal mitocondrial, a produção de ATP, vazamento de prótons, a respiração máxima e capacidade respiratória livre, em um único ensaio.
Este protocolo representa um método para a avaliação do fenótipo bioenergética em células endoteliais vasculares cerebrais. Ele serve como um ensaio de base para a avaliação mitocondrial de células endoteliais, e é óptima para experiências concebidas para investigar os mecanismos de estímulos que podem afectar a via de sinalização mitocondrial em células ECV. Ele também fornece um método para testar agentes terapêuticos potenciais para doenças BBB-perturbações associadas.
Passos críticos dentro do Protocolo
bioanalyzers fluxo extracelular tem a capacidade de medir OCR em tempo real. Neste ensaio, identificando a densidade celular apropriada é crítica. Se a densidade de células é inferior a 8 x 10 3 culas por po, o OCR basal é muito baixa para ser analisado (Figura 2 e Figura 3); Se a densidade de células é superior a 32 x 10 3 culas por po, as células não respondem a oligomicina ou FCCP treatmeNTS (Figura 2 e Figura 3). A densidade celular óptima para esta linha de células no nosso modelo experimental é de 16 × 10 3 células por poço, o que demonstra resultados replicáveis e sensibilidade a estímulos 7 e tratamentos 10,14. Se um Bioanalyzer de 24 poços é usado, novas titulações da densidade celular seria necessário para o ensaio.
Ele está documentado que CVEs têm um grande volume de mitocôndrias em comparação com outras células endoteliais ou tipos de tecido 15,16, sugerindo a necessidade de uma maior produção de energia e menos células para medir o metabolismo bioenergética. Nós testamos vários tipos de células endoteliais do cérebro, tais como primário e imortalizado células endoteliais vasculares cerebrais murino 7 e imortalizado células endoteliais vasculares cerebrais humanos (dados não publicados). Estas células necessária densidades celulares semelhantes para atingir o OCR (respiração basal OCR aceitável dentro de 40-160 pmol / min duranteplacas de 96 poços e 50-400 pmol / min para placas de 24 poços), quando o ensaio foi realizado bioenergética. Kaczara et al. Relataram que mede o metabolismo bioenergético em células humanas umbilical veia endoteliais (HUVEC), que usou uma densidade celular mais elevada 17.
O nosso grupo não avaliou células dos vasos de outros tecidos ou órgãos. Teoricamente, o Bioanalyzer poderia potencialmente ser usado em qualquer tipo de célula, mas requer optimizar o ensaio para a densidade celular, meio de cultura de células, e as condições de cultura (algumas células específicas podem exigir placas revestidas a crescer bem). É necessário que as experiências são concluídas para assegurar a taxa de OCR está dentro da gama aceitável. Se o OCR em células endoteliais de outros órgãos é inferior a partir de cérebros de AVCs, aumentando a densidade celular pode ajudar a obter dentro de um intervalo aceitável de OCR. Alternativamente, se as células não estão usando fosforilação oxidativa como a sua principal fonte de energia, o Bioanalyzer não seria uma optimal ensaio.
O Bioanalyzer permite a interrupção sequencial da cadeia de transporte de elétrons, com base na ordem em que são aplicados os reagentes. Em primeiro lugar, é aplicada oligomicina, que inibe complexo V mitocondrial (ATP sintase). Em segundo lugar, FCCP, um desacoplador de electrões, é aplicada, o que conduz ao rompimento do gradiente de protões. Finalmente, rotenona e antimicina A, que inibem mitocondrial Complexos I e III, respectivamente, são aplicados a levar a uma inibição total do fluxo de electrões. A ordem de exposição à droga é essencial porque as drogas que bloqueiam a reação específica da cadeia de transporte de elétrons, e as mudanças sequenciais podem ser mensurados para refletir a função mitocondrial.
Modificações e resolução de problemas
Para avaliar a resposta a estímulos mitocondrial em células ECV, recomenda-se que os estímulos são aplicados às células após as células aderidas ao fundo da placa de cultura celular (ver a linha de tempomostrado na Figura 1; geralmente leva pelo menos 6 h). Para obter resultados reproduzíveis pelos tratamentos, é extremamente importante para manter a densidade celular consistente. Se pré-tratamentos são concebidos antes da semeadura de células, densidade celular para cada pré-tratamento devem ser cuidadosamente medido, excluindo as células mortas para semeadura. Se transfecção está incluído na concepção experimental, referem-se a transfecção protocolo do fabricante. Demonstrado nos dados apresentados na Figura 4, o miR-34a foi transfectado para as células ECV utilizando um kit de lipofectamina a transfecção, o que requer meio de cultura celular antibióticos livres e um teste de MITO-tensão para avaliar as alterações na função metabólica com a sobre-expressão de miR-34a . As doses de plasmídeo também pode ser optimizada, como anteriormente publicado a 13. Outra modificação que pode ser feita com o protocolo é a alteração das concentrações dos reagentes. Uma curva de titulação de oligomicina, FCCP, e / ou rotenona e antimicina A pode ser completed.
Além disso, se este ensaio é utilizado para análises de elevado rendimento de várias drogas, sugere-se a incluir um ensaio paralelo para medir a viabilidade celular e a proliferação celular, o que foi descrito nas nossas publicações anteriores 7,13. Os valores de OCR é significativamente afectada pelo número de células (Figuras 2 e 3), e os ensaios de proliferação e viabilidade celular beneficiar a normalização dos dados. No entanto, a conclusão destes ensaios são a critério de cada laboratório individual.
Limitações da técnica
A principal limitação deste protocolo é que nós só usamos um modelo in vitro cultura de células di no estudo. Actualmente, não existem disponíveis modelos ex vivo ou modelos animais que podem dirigir a função mitocondrial de células endoteliais. Os novos modelos são esperados para ser desenvolvida para a avaliação da função in vivo e bioenergética <em> ex vivo em estudos futuros.
Outra limitação é a extensão das avaliações de barreira seguintes medidas bioenergética. As experiências não pode ser executada porque, em primeiro lugar, após a realização das medições bioenergéticos, a viabilidade celular diminui a seguir a interrupção completa da cadeia de transporte de electrões; segundo, placas e inserções de cultura de células específicas são necessárias para detectar valores bioenergética e não se encaixam inserções para as avaliações de barreira. Portanto, não há muitos ensaios funcionais que podem ser concluídas após o ensaio de bioenergética. No entanto, espera-se que os dispositivos especiais podem ser desenvolvidos para executar ensaios funcionais antes do ensaio bioenergética.
Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos
As técnicas anteriores para avaliar a função mitocondrial exigiu o isolamento das mitocôndrias das células 18. este neW técnica usando o Bioanalyzer permite a medição da actividade mitocondrial em células intactas, o que preserva mais do ambiente celular do que avaliar mitocôndrias isoladas.
Aplicações futuras ou chegar depois de dominar esta técnica
Este protocolo foi concebido e desenvolvido para a linha celular bEnd.3, mas também é compatível com endotelial vascular cerebral primário (pCVE) 7 ou outras células do endotélio, e demonstramos isto na nossa publicação anterior utilizando células pCVE 7. Quando são utilizados outros tipos de endotélio, o revestimento da placa de cultura e a utilização de factores de crescimento pode ser necessária. No entanto, o ensaio de titulação é recomendado para outros tipos de células, bem. Este protocolo oferece um método geral a ser adoptada na avaliação dos bioenergética de células ECV, e pode ser adicionalmente aplicado para estudos de mecanismos ou respostas terapêuticos desta maneira.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the following grants: AHA 16SDG31170008 to X.R. and NIH P20 GM109098, P01 AG027956, and U54 GM104942 to J.W.S.
bEnd.3 cell line | ATCC | CRL-2299 | 25-30 passages |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S12450 | 10% in final |
Penicillin/Steptomycin | Hyclone | SV30010 | 1×100 stocking |
0.25% trypsin 0.03% EDTA solution | Corning | 25-053-CI | |
Sodium pyruvate | Corning | 25-000-CI | 1.0 µM in final |
Glucose | Sigma | CAS 50-99-7 | 25 mM in final |
Oligomycin | Sigma | O4876 | 1.0 µM in final |
Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | 0.5 µM in final |
Rotenone | Sigma | R8875 | 1.0 µM in final |
Antimycin A | Sigma | CAS 1397-94-0 | 1.0 µM in final |
Plate wash station | Seahorse Bioscience | ||
Extracellular flux bioanayzer | Seahorse Bioscience | XFe96 | |
Extracellular flux cell culture plate | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
Extracellular flux sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
Extracellular flux calibrant solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
Extracellular flux assay medium | Seahorse Bioscience | 102365-100 | PH buffered prior to assay |