קולון-26 קרצינומה גידול נושאות עכבר כמודל לחקר סרטן תשישות
Summary
Mice bearing the Colon-26 (C26) carcinoma represent a classical model of cancer cachexia. Progressive muscle wasting occurs in association with tumor growth, over-expression of muscle-specific ubiquitin ligases, and reductions in muscle cross-sectional area. Fat loss is also observed. Cachexia is studied in a time-dependent manner with increasing severity of wasting.
Abstract
Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and activation of lipolysis and proteolysis systems. Cancer patients with cachexia benefit less from anti-neoplastic therapies and show increased mortality1. Several animal models have been established in order to investigate the molecular causes responsible for body and muscle wasting as a result of tumor growth. Here, we describe methodologies pertaining to a well-characterized model of cancer cachexia: mice bearing the C26 carcinoma2-4. Although this model is heavily used in cachexia research, different approaches make reproducibility a potential issue. The growth of the C26 tumor causes a marked and progressive loss of body and skeletal muscle mass, accompanied by reduced muscle cross-sectional area and muscle strength3-5. Adipose tissue is also lost. Wasting is coincident with elevated circulating levels of pro-inflammatory cytokines, particularly Interleukin-6 (IL-6)3, which is directly, although not entirely, responsible for C26 cachexia. It is well-accepted that a primary mechanism by which the C26 tumor induces muscle tissue depletion is the activation of skeletal muscle proteolytic systems. Thus, expression of muscle-specific ubiquitin ligases, such as atrogin-1/MAFbx and MuRF-1, represent an accepted method for the evaluation of the ongoing muscle catabolism2. Here, we present how to execute this model in a reproducible manner and how to excise several tissues and organs (the liver, spleen, and heart), as well as fat and skeletal muscles (the gastrocnemius, tibialis anterior, and quadriceps). We also provide useful protocols that describe how to perform muscle freezing, sectioning, and fiber size quantification.
Introduction
לבזבז שריר הוא סיבוך חמור של מצבים רפואיים שונים, כגון סרטן, אלח דם, כבד, שחמת כבד, לב ואי ספיקת כליות, מחלת ריאות חסימתית כרונית, ואיידס. בפרט, מבזבז שרירים ניכרת לפחות 50% מהחולים עם סרטן 1. פסד של שרירי שלד בתוצאות הסרטן מפני שפלת חלבון מוגברת בשל יתר ההפעלה של מערכות פרוטאוליטים שרירי שלד ו / או ירידת חלבון סינתזה 6. ליפוליזה ניכרה גם, מה שמוביל הדלדול של רקמת שומן. תשישות קלינית, קשורה באיכות מופחתת ואורך החיים מוערך סיבת המוות ב 20 – 30% מהחולים בסרטן 7. שימוש במודלים ניסיוניים הדומות למחלות האנושיות ככל האפשר יהיה מועיל. במודל חיה אופטימלי מאופיין שחזור גבוה, כמו גם על ידי התערבות מוגבלת מטיפולים שונים והגורמים הצפויים שלדיאטה, מין, ועל רקע גנטי כי הם בדרך כלל משויכים מצבו הקליני 8. עד כה, תשישות הסרטן נחקרה בעיקר במודלים של בעלי חיים המאופיינת השתלה של תאים סרטניים או הזרקה של חומרים מסרטנים, למרות שיטה חדשה היא להשתמש מהונדסים גנטיים עכברים רגישים להתפתחות הסרטן.
בעכברים נושאי קרצינומה C26 (המכונה גם נקודתיים-26 ו אדנוקרצינומה) מייצגים מודל היטב מאופיין בהרחבה בשימוש של תשישות סרטן 2,5. הצמיחה של תוצאות הגידול C26 בגוף וירידה במשקל שרירים, בעיקר באמצעות שומן משופרת חלבון פירוק 9. באופן כללי, משקל גידול 10% לעומת משקל גוף הכולל קשור לירידה של 20-25% ממשקל שרירי שלד דלדול יותר של שומן 3,10. Hepatomegaly ו splenomegaly הם נצפו גם עם צמיחת הגידול, יחד עם הפעלת התגובה בשלב החריף ואת הגובה של infla פרורמות ציטוקינים mmatory 3,11. בין אלה, זה ידוע היטב כי IL-6 ממלא תפקיד מרכזי בתיווך לבזבז שריר במודל C26, למרות ציטוקינים זה הוא כנראה לא inducer רק של תשישות 12. מוגבה IL-6 הגורם לניוון שרירים דרך שפעול מסלול JAK / STAT3, עיכוב גורם שעתוק זה יכול למנוע שריר מבזבז 3,4.
במהלך לבזבז שרירים הנגרמת C26, כמו במצבים רבים של ניוון שרירים, מסת שריר הוא איבד בעיקר באמצעות הפחתת תכולת החלבון בשריר פני סיבי השריר, ולא דרך מוות של תאים או אובדן סיבי 13. בשנת תשישות C26, תזוזה לעבר אזורים חתך קטן הוא ציין הן בסיבים glycolytic חמצוני 2. זה גם עולה בקנה אחד עם כוח שרירים מופחת 5. קבוצות רבות ברחבי העולם לקחו את היתרון של מודל C26 כדי לגלות מתווכים חדשים של בזבוז שריר או תרופות רלוונטיות קלינית עבור CAC סרטןhexia. עם זאת, נהלים שונים עבור השימוש במודל זה דווחו, מעלה חששות על העקביות של הנתונים שהתקבלו פוזות חסמי שחזור בתנאי ניסוי שונים. כאן אנו מדווחים על שימוש טיפוסי של מודל זה לחקר תשישות הסרטן אשר מניבה נתונים מותאמים לשחזור.
Protocol
Representative Results
Discussion
במיוחד בשלבים האחרונים שלה, סרטן המעי הגס הוא קשור להתפתחות של תשישות, האחראית על תוצאות פחות טובות וירידה באיכות חיי המטופל. מחקרים רבים התמקדו בטיפול תנאים משני לסרטן; עם זאת, למרות מאמצים רבים בכיוון זה, עדיין אין טיפול מאושר תשישות סרטן 21. לפיכך, קיים הכרח כי …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Richard Lieber and Shannon Bremner for their ImageJ macro and instructions. While at Thomas Jefferson University, this work was supported by the Pennsylvania Department of Health CURE Grant TJU No. 080-37038-AI0801. Subsequently, this study was supported by a grant to AB from the National Institutes of Health (R21CA190028), and by grants to TAZ from the National Institutes of Health (R01CA122596, R01CA194593), the IU Simon Cancer Center, the Lustgarten Foundation, the Lilly Foundation, Inc., and the IUPUI Pancreas Signature Center.
Materials
| Cell culture Flasks | Falcon – Becton Dickinson | 35-5001 | |
| DMEM | Cellgro | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Streptomycin-Penicillin | Cellgro | 30-002-CI | |
| CD2F1 mice | Harlan | 060 | |
| Anesthesia apparatus | EZ-Anesthesia | EZ-7000 | |
| 2-Methyl Butane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Cork disks | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Superfrost plus glass slides | VWR | 48311-703 | |
| Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody | Vector Laboratories | VP-D508 | |
| Alexa Flour 594 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11062 | |
| Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21211 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | HT110332 | |
| Xylene | Acros Organics | 422680025 | |
| Cytoseal-XYL | Thermo | 8312-4 | |
| Microscope | Zeiss | Observer.Z1 | |
| Bamboo Tablet | Wacom | CTH-661 | |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | ||
| Excel for Mac 2011 | Microsoft Corp. | ||
| Image J | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html |
| Microtainer | BD | 365873 |
Riferimenti
- Tan, B., Fearon, K. Cachexia: prevalence and impact in medicine. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 11, 400-407 (2008).
- Aulino, P., et al. Molecular cellular and physiological characterization of the cancer cachexia-inducing C26 colon carcinoma in mouse. BMC cancer. 10, 363 (2010).
- Bonetto, A., et al. STAT3 activation in skeletal muscle links muscle wasting and the acute phase response in cancer cachexia. PloS One. 6, e22538 (2011).
- Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. Am J Physiol Endocrinol Metab. 303, E410-E421 (2012).
- Bonetto, A., et al. Deacetylase inhibitors modulate the myostatin/follistatin axis without improving cachexia in tumor-bearing mice. Current Cancer Drug Targets. 9, 608-616 (2009).
- Acharyya, S., et al. Cancer cachexia is regulated by selective targeting of skeletal muscle gene products. The Journal of Clinical Investigation. 114, 370-378 (2004).
- Fearon, K., et al. Definition and classification of cancer cachexia: an international consensus. The Lancet Oncology. 12, 489-495 (2011).
- Holecek, M. Muscle wasting in animal models of severe illness. Int J Exp Pathol. 93, 157-171 (2012).
- Acharyya, S., et al. Dystrophin glycoprotein complex dysfunction: a regulatory link between muscular dystrophy and cancer cachexia. Cancer Cell. 8, 421-432 (2005).
- Benny Klimek, ., E, M., et al. Acute inhibition of myostatin-family proteins preserves skeletal muscle in mouse models of cancer cachexia. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391, 1548-1554 (2010).
- Pedroso, F. E., et al. Inflammation, organomegaly, and muscle wasting despite hyperphagia in a mouse model of burn cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 199-211 (2012).
- Soda, K., Kawakami, M., Kashii, A., Miyata, M. Manifestations of cancer cachexia induced by colon 26 adenocarcinoma are not fully ascribable to interleukin-6. International journal of cancer. 62, 332-336 (1995).
- Costelli, P., et al. IGF-1 is downregulated in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291, R674-R683 (2006).
- Palus, S., Akashi, Y., von Haehling, S., Anker, S. D., Springer, J. The influence of age and sex on disease development in a novel animal model of cardiac cachexia. International Journal of Cardiology. 133, 388-393 (2009).
- Norman, K., et al. Effect of sexual dimorphism on muscle strength in cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 111-116 (2012).
- Stephens, N. A., et al. Sexual dimorphism modulates the impact of cancer cachexia on lower limb muscle mass and function. Clinical Nutrition. 31, 499-505 (2012).
- Cosper, P. F., Leinwand, L. A. Cancer causes cardiac atrophy and autophagy in a sexually dimorphic manner. Ricerca sul cancro. 71, 1710-1720 (2011).
- Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49, 319-323 (1999).
- Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Rep. 4, 732 (2015).
- Minamoto, V. B., et al. Increased efficacy and decreased systemic-effects of botulinum toxin A injection after active or passive muscle manipulation. Dev Med Child Neurol. 49, 907-914 (2007).
- Murphy, K., Lynch, G. Update on emerging drugs for cancer cachexia. Expert Opin Emerg Drugs. 14, 619-632 (2009).
- Seto, D. N., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. A Key Role for Leukemia Inhibitory Factor in C26 Cancer Cachexia. The Journal of Biological Chemistry. 290, 19976-19986 (2015).
- Judge, S. M., et al. Genome-wide identification of FoxO-dependent gene networks in skeletal muscle during C26 cancer cachexia. BMC Cancer. 14, 997 (2014).
- Kliewer, K. L., et al. Adipose tissue lipolysis and energy metabolism in early cancer cachexia in mice. Cancer Biol Ther. 16, 886-897 (2015).
- Aversa, Z., et al. Changes in myostatin signaling in non-weight-losing cancer patients. Ann Surg Oncol. 19, 1350-1356 (2012).
- Bonetto, A., et al. Early changes of muscle insulin-like growth factor-1 and myostatin gene expression in gastric cancer patients. Muscle Nerve. 48, 387-392 (2013).
- Lazarus, D. D., et al. A new model of cancer cachexia: contribution of the ubiquitin-proteasome pathway. The American Journal of Physiology. 277, E332-E341 (1999).
- al-Majid, S., McCarthy, D. O. Resistance exercise training attenuates wasting of the extensor digitorum longus muscle in mice bearing the colon-26 adenocarcinoma. Biol Res Nurs. 2, 155-166 (2001).
- Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 303. 303, E410-E421 (2012).
- Samuels, S. E., et al. Liver protein synthesis stays elevated after chemotherapy in tumour-bearing mice. Cancer Lett. 239, 78-83 (2006).
- Cornwell, E. W., Mirbod, A., Wu, C. L., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. C26 cancer-induced muscle wasting is IKKbeta-dependent and NF-kappaB-independent. PloS One. 9, e87776 (2014).
- Penna, F., et al. Muscle wasting and impaired myogenesis in tumor bearing mice are prevented by ERK inhibition. PloS One. 5, e13604 (2010).
