Etikettering van borstkanker-Patient afgeleid Xenograften met Traceable Verslaggevers voor tumorgroei en metastase Studies
Summary
We beschrijven een methode voor stabiele kenmerken van de patiënt afgeleide xenotransplantaten (PDXs) met lentivirale deeltjes uiten van groen fluorescerend eiwit en luciferase reporters. Deze werkwijze maakt het volgen van de groei van PDXs op de primaire locatie, alsmede detectie spontane en experimentele metastasen gebruik in vivo beeldvorming.
Abstract
The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients’ tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.
Introduction
De ontwikkeling van de patiënt afgeleide tumor xenotransplantaten (PDXs), waarbij chirurgisch weggesneden tumor samples direct in immuun-gecompromitteerde muizen worden geënt, biedt een aantal voordelen ten opzichte van standaard cellijn xenograft modellen en vormt een belangrijke stap vooruit in het onderzoek naar kanker 1,2. PDXs kunnen worden gehandhaafd en uitgebreid door opeenvolgende doorgangen met een minimale verandering van de genetische en biologische eigenschappen van de tumor gegroeid bij de eerste doorgang; en een betere weerspiegeling van de tumor heterogeniteit dan xenotransplantaten afgeleid van kanker bij de mens cellijnen 3-8. Deze modellen worden nu op grote schaal gebruikt als platform voor het personaliseren van kanker geneeswijze 9,10, als een preklinische platform in de ontwikkeling van geneesmiddelen 6,11 en als een experimenteel instrument voor de studie van de biologie van kanker 4,12.
De meeste PDXs worden geïmplanteerd en subcutaan gepropageerd, die haalbaar maakt meting van de groei van de tumor in de tijd met behulp van remklauwen. Echter, Metastatische ziekte is moeilijker geweest om te modelleren met behulp van PDXs. Specifiek voor borstkanker xenotransplantaten met metastatische vermogen uiteenlopende organen beschreven 3,5,13, maar de frequentie van spontane verspreiding metastasen is extreem laag. Wanneer gemeld, de identificatie en kwantificatie van metastatische last beroept zich moeizaam histologisch onderzoek van doelorganen post-mortem. cel kanker lijnen tot expressie bioluminescent (luciferase, Luc) of fluorescentie (Green Fluorescent Protein, GFP) gen reporters worden vaak gebruikt in experimentele modellen van borstkanker uitzaaiingen hersenen, longen, bot en lever na intracardiale, staart-ader, intrafemoral en milt injectie 14-16. Hoewel deze modellen omzeilen verspreiding van de primaire tumoren, zijn ze waardevol voor de mechanismen van orgaan tropisme en metastatische kolonisatie bestuderen. Echter, cellen afkomstig van primaire tumoren en patiënt PDXs kunnen lage transfectie of transductie tarieven usin hebbeng-standaard procedures. Een alternatief is PDX-afgeleide cellijnen in vitro vastgesteld 17, die vervolgens kan worden gelabeld met conventionele weefselkweek protocollen. Deze aanpak is echter niet geschikt voor het labelen meeste PDXs waarvoor cellijn afleiding moeilijk en kan het fenotype van de cellen te veranderen. Hier presenteren we een protocol voor transductie van PDX-gedissocieerde tumorcellen met lentivirale vectoren die geschikt zijn voor in vivo beeldvorming. Daarnaast beschrijven we experimenteel métastase via intracardiale injectie van gedissocieerde luc-GFP gemerkte cellen PDX in immuungecompromitteerde muizen.
Een basis protocol voor transductie van PDX-gedissocieerd organoids met gen-reporter tot expressie lentivirus is eerder beschreven 18. In het huidige protocol andere methoden beschrijven we te verrijken voor humane tumorcellen en het verkrijgen van bijna 100% transductie efficiëntie en het gebruik van gelabelde PDXs voor het detecteren experimentele borstkankermetastasen. Dit protocol kan worden aangepast voor het labelen van verschillende kankersoorten PDXs met verschillende luminescerende en fluorescerende merkers en modulatie van genexpressie (dat wil zeggen, shRNA knockdown van genen van belang).
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen in het protocol:
Het gebruik van hoge titer lentivirale deeltjes (> 10 8 TU / ml) is een kritische stap in het succes van dit protocol, zoals laat zorgvuldige controle van de mediumsamenstelling tijdens in vitro transductie. Hoewel verschillende werkwijzen voor de productie van hoge titer virale deeltjes zijn goed beschreven 18,19; Dit protocol gebruikt lentivirale deeltjes zoals uitgebreid beschreven in <a href="http://www…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken dr Darrel Kotton aan de Boston University voor het verstrekken van de faag-EF1aL-DsRed-UBC-GFP-W vector en protocollen voor hoge titer lentivirale productie gebruikt in deze studies. Dit werk werd gefinancierd door DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) en R01 CA140985 (CAS) .NCI P30CA046934 Center subsidie ondersteund in vivo imaging en weefselkweek kernen aan de Universiteit van Colorado AMC.
Materials
| DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
| EGF | BD Biosciences | 354001 | |
| Heparin | Sigma | H4784 | |
| B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
| Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| HBSS Red Ca++/Mg++ free | Hyclone | SH30031.02 | |
| Hepes | |||
| 10X PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
| Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
| 30C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
| 70um filters | Falcon | 7352350 | |
| scalpels | Fisher | 22079690 | |
| Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
| Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
| Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
| EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
| Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
| Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
| Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
| Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
| Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
| Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |
Riferimenti
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Kabos, P., et al. Patient-derived luminal breast cancer xenografts retain hormone receptor heterogeneity and help define unique estrogen-dependent gene signatures. Breast cancer research and treatment. 135 (2), 415-432 (2012).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Lum, D. H., Matsen, C., Welm, A. L., Welm, B. E. Overview of human primary tumorgraft models: comparisons with traditional oncology preclinical models and the clinical relevance and utility of primary tumorgrafts in basic and translational oncology research. Curr Protoc Pharmacol. , (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clin Cancer Res. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Garrido-Laguna, I., et al. Tumor engraftment in nude mice and enrichment in stroma- related gene pathways predict poor survival and resistance to gemcitabine in patients with pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 17 (17), 5793-5800 (2011).
- Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Res. 15 (1), 201 (2013).
- Norum, J. H., Andersen, K., Sorlie, T. Lessons learned from the intrinsic subtypes of breast cancer in the quest for precision therapy. Br J Surg. 101 (8), 925-938 (2014).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Res. 16 (2), R36 (2014).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat Rev Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Powell, E., et al. p53 deficiency linked to B cell translocation gene 2 (BTG2) loss enhances metastatic potential by promoting tumor growth in primary and metastatic sites in patient-derived xenograft (PDX) models of triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res. 18 (1), (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. , (2013).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
- Indumathi, S., et al. Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology. Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).
- Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias. Nat Commun. 6, 6927 (2015).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (67), e4260 (2012).
- Kang, Y. Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis. Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).
- Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).
- Lawson, D. A., et al. Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells. Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).
