نحن تصف طريقة لوضع العلامات مستقر من xenografts المستمدة من المريض (PDXs) مع جزيئات lentiviral التعبير عن بروتين ووسيفيراز صحفيين الأخضر الفلورسنت. وتسمح هذه الطريقة لتتبع نمو PDXs في الموقع الأساسي، وكذلك الكشف عن الانبثاث عفوية والتجريبية استخدام في أنظمة التصوير الجسم الحي.
The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients’ tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.
تطوير xenografts المستمدة من المريض ورم (PDXs)، حيث يتم المغروسة عينات الورم جراحيا مقطوعة مباشرة في الفئران المناعية للخطر، ويقدم العديد من المزايا نماذج طعم أجنبي خط الخلية القياسية، ويمثل تقدما كبيرا في مجال أبحاث السرطان 1،2. PDXs يمكن الحفاظ على وتوسيعها من خلال الممرات المتعاقبة مع تغيير الحد الأدنى من الخصائص الوراثية والبيولوجية للورم نمت في الممر الأول. ويعكس بشكل أدق عدم التجانس ورم من xenografts المستمدة من خطوط الخلايا السرطانية البشرية 3-8. تستخدم الآن هذه النماذج على نطاق واسع باعتباره منصة لإضفاء الطابع الشخصي علاجات السرطان 9،10، كمنصة قبل السريرية في تطوير العقاقير 6،11 وكأداة تجريبية لدراسة سرطان علم الأحياء 4،12.
تزرع معظم PDXs ونشر تحت الجلد، والذي يسمح عمليا قياس نمو الورم أكثر من مرة باستخدام الفرجار. ومع ذلك، وكان المرض المنتشر أكثر صعوبة للنموذج باستخدام PDXs. على وجه التحديد لسرطان الثدي، وقد وصفت xenografts مع قدرة النقيلي إلى أجهزة مختلفة 3،5،13، ولكن وتيرة نشر التلقائي لمواقع النقيلي منخفضة للغاية. حيث ذكرت، وتحديد وتقدير العبء المنتشر يعتمد في الفحص النسيجي شاقة من الأجهزة المستهدفة بعد الوفاة. خطوط الخلايا السرطانية معربا عن إضاءة الحيوية (وسيفيراز، لوك) أو الفلورسنت وتستخدم (البروتين الفلوري الأخضر، GFP) للصحفيين الجين عادة في النماذج التجريبية الانبثاث سرطان الثدي إلى الدماغ والرئة والعظام والكبد بعد داخل القلب، الذيل الوريد، intrafemoral وحقن الطحال 14-16. في حين أن هذه النماذج تجاوز نشر من الأورام الأولية، فهي قيمة لدراسة آليات مع الأجسام الجهاز والاستعمار النقيلي. ومع ذلك، يمكن أن الخلايا المشتقة من الأورام وPDXs المريض الأساسية وتدني ترنسفكأيشن أو معدلات التنبيغ النقيبز الإجراءات القياسية. بديل واحد هو لإنشاء خطوط الخلايا المشتقة PDX في المختبر 17، والتي يمكن بعد ذلك وصفت باستخدام بروتوكولات زراعة الأنسجة التقليدية. هذا النهج ومع ذلك، ليست مناسبة لوصفها معظم PDXs، الذي خط خلية الاشتقاق هو الصعب، ويمكن تغيير النمط الظاهري للخلايا. هنا نقدم بروتوكول للتنبيغ الخلايا السرطانية فصلها PDX مع ناقلات lentiviral مناسبة للتصوير في الجسم الحي. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف الانبثاث التجريبي باستخدام الحقن داخل القلب من خلايا PDX فصلها لوك-GFP المسمى في الفئران المناعة.
قد سبق ووصف البروتوكول الأساسي لتنبيغ organoids فصل PDX مع الجينات مراسل التعبير عن الفيروسة البطيئة 18. في البروتوكول الحالي وصفنا طرق إضافية لإثراء للخلايا السرطانية البشرية والحصول على قرب 100٪ كفاءة ترنسدوكأيشن، فضلا عن استخدام PDXs المسمى للكشف عن سرطان الثدي التجريبيالانبثاث. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لوصفها أنواع متعددة من السرطان من PDXs مع مختلف علامات الانارة والفلورسنت وكذلك تعديل التعبير الجيني (أي ضربة قاضية shRNA الجينات من الفائدة).
الخطوات الحاسمة في البروتوكول:
استخدام جزيئات lentiviral ارتفاع عيار (> 10 8 TU / مل) هو خطوة حاسمة في نجاح هذا البروتوكول، كما يتيح التحكم الدقيق للتكوين وسائل الإعلام في المختبر خلال تنبيغ. في حين أساليب متعددة لإنت…
The authors have nothing to disclose.
الكتاب أشكر الدكتور داريل Kotton في جامعة بوسطن لتوفير فج-EF1aL-عن dsRed-UBC-GFP-W ناقلات والبروتوكولات لارتفاع عيار إنتاج lentiviral المستخدمة في هذه الدراسات. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة الدفاع BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC)، ACS IRG # 57-001-53 (DMC)، NCI K22CA181250 (DMC) و R01 CA140985 (CAS) منحة .NCI مركز P30CA046934 دعم في مجال التصوير فيفو وزراعة الأنسجة النوى في جامعة كولورادو AMC.
DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
EGF | BD Biosciences | 354001 | |
Heparin | Sigma | H4784 | |
B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
HBSS Red Ca++/Mg++ free | Hyclone | SH30031.02 | |
Hepes | |||
10X PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
30C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
70um filters | Falcon | 7352350 | |
scalpels | Fisher | 22079690 | |
Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |