אנו מתארים שיטת תיוג יציב של xenografts נגזרות החולות (PDXs) עם חלקיקי lentiviral להביע כתבי חלבון בלוציפראז ירוקים-ניאון. שיטה זו מאפשרת מעקב צמיחת PDXs המצוי באתר הראשי, כמו גם באיתור גרורות ספונטניות ניסיון באמצעות במערכות הדמית vivo.
The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients’ tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.
התפתחות xenografts גידול נגזר החולה (PDXs), שבו ניתוח דגימות גידול resected הן engrafted ישירות לעכברי חיסון נפגע, מציעה מספר יתרונות על פני מודלי xenograft תא-קו רגילים ומייצגת התקדמות גדולה בחקר סרטן 1,2. PDXs יכול להישמר והרחיב על ידי קטעים רצופים עם שינוי מזערי של תכונות גנטיות וביולוגיות של הגידול גדל במעבר הראשון; ועוד לשקף במדויק ההטרוגניות גידול מ xenografts נגזר שורות תאים אנושיים סרטן 3-8. מודלים אלה נמצאים כיום בשימוש נרחב כפלטפורמה אישית בריפוי הסרטן 9,10, בתור פלטפורמה פרה בפיתוח תרופות 6,11 וככלי ניסיוני לחקר הביולוגיה סרטן 4,12.
רוב PDXs מושתל מופץ תת עורי, אשר יתכן מאפשר מדידה של גידול לאורך זמן באמצעות מחוגה. למרות זאתהמחלה, גרורתי כבר יותר קשה מודל באמצעות PDXs. באופן ספציפי לסרטן השד, xenografts עם קיבולת גרורתי לאיברים שונים תואר 3,5,13, אבל התדר של הפצה ספונטנית לאתרים גרורתי הוא נמוך ביותר. איפה דוח זיהוי וכימות של ניטל גרורתי מסתמכים בבדיקה היסטולוגית מייגעת של אברי מטרה שלאחר מוות. שורות תאים סרטניים המבטאים bioluminescent (בלוציפראז, לוק) או פלורסנט (חלבון פלואורסצנטי ירוק, GFP) לכתבי גן משמשות בדרך כלל במודל ניסיוני של גרורות סרטן השד למוח, ריאות, עצמות וכבדות לאחר intracardiac, זנב-וריד, intrafemoral הזרקת טחול 14-16. בעוד המודלים האלה לעקוף הפצה מן הגידולים הראשוניים, הם בעלי ערך כדי לחקור את המנגנונים של כמיהות איברי קולוניזציה גרורתית. עם זאת, בתאים שמקורם בגידולים ו PDXs מטופל עיקריים יכולים להיות שיעורי תמרה או transfection נמוך usinנהלים קבועים גרם. חלופה אחת היא להקים שורות תאי PDX-derived במבחנת 17, אשר יכול להיות מתויג מכן באמצעות פרוטוקולים בתרבית רקמה קונבנציונליים. גישה זו לעומת זאת, אינה מתאימה התיוג ביותר PDXs, עבורו גזירת תא אונליין קשה והוא יכול לשנות את הפנוטיפ של התאים. כאן אנו מציגים פרוטוקול התמרה של תאים סרטניים PDX-ניתק עם וקטורים lentiviral מתאים הדמיה in vivo. בנוסף, אנו מתארים גרורים הניסיונות באמצעות הזרקת intracardiac של תאי PDX-GFP לוק שכותרתו ניתקו בעכברי immunocompromised.
פרוטוקול בסיסי עבור התמרה של organoids PDX-ניתק עם lentivirus להביע כתב הגן בעבר תוארה 18. בפרוטוקול הנוכחי אנו מתארים שיטות נוספות להעשיר עבור תאים סרטניים אנושיים ולקבל ליד יעילות התמר 100%, כמו גם את השימוש PDXs שכותרתו לגילוי סרטן השד הניסיוןגרורות. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור תיוג סוגי הסרטן מרובים של PDXs עם סמנים זורחים ניאון שונים כמו גם אפנון של ביטוי גנים (כלומר, shRNA מציאה של גנים של עניין).
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול:
שימוש חלקיקי lentiviral גבוהה כייל (> 10 8 TU / ml) הוא צעד חיוני בהצלחתה של פרוטוקול זה, כמו מאפשר שליטה קפדנית של רכב התקשורת במהלך תמרה במבחנה. בעוד מספר שיטות לייצור חלקיקים נגיפיים גבו…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים ד"ר דארל Kotton באוניברסיטת בוסטון למתן וקטור הפאג-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W ופרוטוקולים לייצור lentiviral כייל גבוה שימוש במחקרים אלה. עבודה זו מומנה על ידי DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) ו R01 CA140985 (CAS) .NCI P30CA046934 מרכז נתמך מענק בתחום ההדמיה vivo תרבות רקמות ליבות באוניברסיטת קולורדו AMC.
DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
EGF | BD Biosciences | 354001 | |
Heparin | Sigma | H4784 | |
B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
HBSS Red Ca++/Mg++ free | Hyclone | SH30031.02 | |
Hepes | |||
10X PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
30C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
70um filters | Falcon | 7352350 | |
scalpels | Fisher | 22079690 | |
Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |