हम रोगी व्युत्पन्न xenografts (PDXs) lentiviral कणों हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन और luciferase संवाददाताओं को व्यक्त करने के साथ स्थिर लेबलिंग के लिए एक विधि का वर्णन। इस विधि को प्राथमिक साइट पर PDXs के विकास पर नज़र रखने के लिए, साथ ही इन विवो इमेजिंग सिस्टम में उपयोग करते हुए सहज और प्रायोगिक मेटास्टेसिस का पता लगाने के लिए अनुमति देता है।
The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients’ tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.
रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर xenografts (PDXs), जहां शल्य चिकित्सा resected ट्यूमर के नमूनों सीधे प्रतिरक्षा-समझौता चूहों में engrafted कर रहे हैं के विकास, मानक सेल लाइन जेनोग्राफ्ट मॉडल पर कई लाभ प्रदान करता है और कैंसर अनुसंधान 1,2 में एक प्रमुख अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है। PDXs बनाए रखा और ट्यूमर पहले पारित होने से बढ़ी की आनुवंशिक और जैविक विशेषताओं में से कम से कम परिवर्तन के साथ लगातार मार्ग से विस्तार किया जा सकता है; और अधिक सही मानव कैंसर कोशिका लाइनों 3-8 से निकाली गई xenografts से ट्यूमर विविधता को दर्शाते हैं। इन मॉडलों को अब बड़े पैमाने पर दवा के विकास 6,11 में एक मंच के रूप में preclinical और कैंसर जीव विज्ञान 4,12 अध्ययन के लिए एक प्रायोगिक उपकरण के रूप में, कैंसर चिकित्सा 9,10 व्यक्तिगत के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं।
अधिकांश PDXs प्रत्यारोपित और subcutaneously प्रचारित है, जो feasibly नली का व्यास का उपयोग कर समय के साथ ट्यूमर के विकास की माप की अनुमति देता रहे हैं। तथापि, Metastatic रोग अधिक मुश्किल हो गया है PDXs का उपयोग कर मॉडल करने के लिए। विशेष रूप से स्तन कैंसर के लिए, अलग-अलग अंगों को मेटास्टेटिक क्षमता के साथ xenografts 3,5,13 वर्णित किया गया है, लेकिन मेटास्टेटिक साइट्स के लिए सहज प्रचार-प्रसार की आवृत्ति बहुत कम है। कहाँ सूचना दी, पहचान और मेटास्टेटिक बोझ की मात्रा का ठहराव लक्ष्य अंगों पोस्टमार्टम के श्रमसाध्य ऊतकीय परीक्षा में निर्भर करता है। कैंसर कोशिका लाइनों व्यक्त bioluminescent (luciferase, ल्यूक) या फ्लोरोसेंट (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन, GFP) जीन संवाददाताओं सामान्यतः मस्तिष्क, फेफड़े, intracardiac के बाद हड्डी और लीवर, पूंछ-नस, intrafemoral और प्लीहा इंजेक्शन के लिए स्तन कैंसर मेटास्टेसिस की प्रयोगात्मक मॉडल में इस्तेमाल कर रहे हैं 14-16। इन मॉडलों प्राथमिक ट्यूमर से प्रचार-प्रसार बाईपास, वे अंग tropism और मेटास्टेटिक उपनिवेशवाद के तंत्र का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान हैं। हालांकि, प्राथमिक रोगी ट्यूमर और PDXs से ली गई कोशिकाओं कम अभिकर्मक या पारगमन दरों usin हो सकता हैजी मानक प्रक्रियाओं। एक वैकल्पिक विट्रो 17 है, जो तब पारंपरिक टिशू कल्चर प्रोटोकॉल का उपयोग लेबल किया जा सकता में PDX व्युत्पन्न सेल लाइनों की स्थापना है। यह दृष्टिकोण हालांकि, ज्यादातर PDXs, जिसके लिए सेल लाइन व्युत्पत्ति मुश्किल है और कोशिकाओं के phenotype बदल सकते हैं लेबलिंग के लिए उपयुक्त नहीं है। यहाँ हम vivo इमेजिंग के लिए उपयुक्त lentiviral वैक्टर के साथ PDX-अलग ट्यूमर कोशिकाओं के पारगमन के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इसके अलावा, हम immunocompromised चूहों में अलग-ल्यूक GFP लेबल PDX कोशिकाओं के intracardiac इंजेक्शन का उपयोग प्रायोगिक मेटास्टेसिस का वर्णन है।
जीन-रिपोर्टर व्यक्त lentivirus के साथ PDX-अलग organoids के पारगमन के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल पहले 18 में वर्णित किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल में हम मानव ट्यूमर कोशिकाओं के लिए समृद्ध और 100% पारगमन दक्षता के पास प्राप्त करने के लिए, साथ ही प्रयोगात्मक स्तन कैंसर का पता लगाने के लिए लेबल PDXs के उपयोग के अतिरिक्त विधियों का वर्णनमेटास्टेसिस। इस प्रोटोकॉल विभिन्न luminescent और फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ PDXs के कई प्रकार के कैंसर के साथ ही जीन अभिव्यक्ति (यानी, shRNA ब्याज की जीन की पछाड़ना) के मॉडुलन लेबलिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम:
उच्च अनुमापांक lentiviral कणों के उपयोग (> 10 8 टीयू / एमएल), इस प्रोटोकॉल की सफलता में एक महत्वपूर्ण कदम है इन विट्रो पारगमन के दौरान मीडिया रचना का साव?…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों फेज-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W वेक्टर और उच्च अनुमापांक lentiviral इन अध्ययनों में प्रयुक्त उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए बोस्टन विश्वविद्यालय में डॉ डेरेल Kotton धन्यवाद। इस काम डीओडी BCRP W81XWH-11-1-0101 (डीएमसी), एसीएस IRG # 57-001-53 (डीएमसी), NCI K22CA181250 (डीएमसी) और R01 CA140985 (कैस) द्वारा वित्त पोषित किया गया .NCI P30CA046934 केंद्र अनुदान vivo इमेजिंग में समर्थित और टिशू कल्चर कोलोराडो एएमसी के विश्वविद्यालय में कोर।
DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
EGF | BD Biosciences | 354001 | |
Heparin | Sigma | H4784 | |
B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
HBSS Red Ca++/Mg++ free | Hyclone | SH30031.02 | |
Hepes | |||
10X PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
30C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
70um filters | Falcon | 7352350 | |
scalpels | Fisher | 22079690 | |
Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |