Märkning av bröstcancerpatient som härrör xenografter med spår Reportrar för tumörtillväxt och metastas studier
Summary
Vi beskriver en metod för stabil märkning av patientgenererade xenotransplantat (PDXs) med lentivirala partiklar som uttrycker grönt fluorescerande protein och luciferas reportrar. Denna metod gör det möjligt att spåra tillväxten av PDXs vid den primära platsen, liksom att upptäcka spontana och experimentella metastaser med hjälp av in vivo imaging system.
Abstract
The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients’ tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.
Introduction
Utvecklingen av patientgenererade tumörxenotransplantat (PDXs), där kirurgiskt resekterade tumörprover ympade direkt i immun äventyras möss, erbjuder flera fördelar jämfört med vanliga cellinje xenograft-modeller och är ett stort framsteg inom cancerforskningen 1,2. PDXs kan bibehållas och expanderas genom successiva passager med minimal förändring av de genetiska och biologiska egenskaperna hos tumören vuxit i den första passagen; och mer exakt återspegla tumör heterogenitet än xenotransplantat som härrör från mänskliga cancercellinjer 3-8. Dessa modeller nu i stor utsträckning används som en plattform för att anpassa cancerterapi 9,10, som en preklinisk plattform inom läkemedelsutveckling 6,11 och som en experimentell verktyg för att studera cancerbiologi 4,12.
De flesta PDXs implanteras och förökas subkutant, vilket är möjligt medger mätning av tumörtillväxt över tiden med hjälp av skjutmått. dock, Metastaserad sjukdom har varit svårare att modellera med hjälp av PDXs. Specifikt för bröstcancer, har xenotransplantat med metastaserande förmåga till olika organ har beskrivits 3,5,13, men frekvensen av spontan spridning till metastaslokalisationer är extremt låg. Där rapporteras förlitar identifiering och kvantifiering av metastaserande börda i mödosam histologisk undersökning av målorgan efter slakt. Cancer cellinjer som uttrycker självlysande (luciferas, Luc) eller fluorescerande (grönt fluorescerande proteinet, GFP) gen reportrar är vanligt förekommande i experimentella modeller av bröstcancermetastaser till hjärna, lunga, ben och lever efter intrakardiell, svans-ven, intrafemoral och mjälten injektion 14-16. Även om dessa modeller kringgå spridning från primära tumörer, de är värdefulla för att studera mekanismerna för organ tropism och metastaser kolonisering. Däremot kan celler härledda från primära patientens tumörer och PDXs har låg transfektion eller transduktion hastigheter using standardprocedurer. Ett alternativ är att etablera PDX-härledda cellinjer in vitro 17, som kan sedan märkas med hjälp av konventionella vävnadsodlingsprotokoll. Detta tillvägagångssätt är emellertid inte lämplig för att märka de flesta PDXs, för vilken cell-linje härledning är svårt och kan ändra fenotypen hos cellerna. Här presenterar vi ett protokoll för transduktion av PDX-dissocierade tumörceller med lentivirala vektorer som är lämpliga för in vivo imaging. Dessutom beskriver vi experimentell metastas använder intrakardiell injektion av dissocierade luc-GFP märkta PDX celler med nedsatt immunförsvar möss.
En grundläggande protokoll för transduktion av PDX-differentierade organoids med gen-reporter uttrycker lentivirus har tidigare beskrivits 18. I det nuvarande protokollet beskriver vi ytterligare metoder för att anrika för humana tumörceller och erhålla nära 100% transduktionseffektiviteten, såväl som användningen av märkta PDXs för detektering av experimentell bröstcancermetastaser. Detta protokoll kan anpassas för att märka flera cancertyper PDXs med olika självlysande och fluorescerande markörer samt modulering av genuttryck (dvs shRNA knockdown av gener av intresse).
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg i protokollet:
Användningen av hög titer lentivirala partiklar (> 10 8 TU / ml) är ett kritiskt steg i framgången för detta protokoll, som möjliggör noggrann kontroll av mediekompositionen under in vitro överföring. Medan flera metoder för produktion av hög titer viruspartiklar har väl beskrivits 18,19; detta protokoll använder lentivirala partiklar framställda som beskrivs i detalj på <a href="http://www.kottonl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Dr Darrel Kotton vid Boston University för att ge fag-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W vektor och protokoll för hög titer Lentiviral produktion användes i dessa studier. Detta arbete har finansierats av DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) och R01 CA140985 (CAS) .NCI P30CA046934 Center bidrag stöds in vivo imaging och vävnadsodling kärnor vid University of Colorado AMC.
Materials
| DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
| EGF | BD Biosciences | 354001 | |
| Heparin | Sigma | H4784 | |
| B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
| Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| HBSS Red Ca++/Mg++ free | Hyclone | SH30031.02 | |
| Hepes | |||
| 10X PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
| Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
| 30C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
| 70um filters | Falcon | 7352350 | |
| scalpels | Fisher | 22079690 | |
| Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
| Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
| Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
| EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
| Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
| Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
| Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
| Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
| Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
| Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |
Riferimenti
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Kabos, P., et al. Patient-derived luminal breast cancer xenografts retain hormone receptor heterogeneity and help define unique estrogen-dependent gene signatures. Breast cancer research and treatment. 135 (2), 415-432 (2012).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Lum, D. H., Matsen, C., Welm, A. L., Welm, B. E. Overview of human primary tumorgraft models: comparisons with traditional oncology preclinical models and the clinical relevance and utility of primary tumorgrafts in basic and translational oncology research. Curr Protoc Pharmacol. , (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clin Cancer Res. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Garrido-Laguna, I., et al. Tumor engraftment in nude mice and enrichment in stroma- related gene pathways predict poor survival and resistance to gemcitabine in patients with pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 17 (17), 5793-5800 (2011).
- Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Res. 15 (1), 201 (2013).
- Norum, J. H., Andersen, K., Sorlie, T. Lessons learned from the intrinsic subtypes of breast cancer in the quest for precision therapy. Br J Surg. 101 (8), 925-938 (2014).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Res. 16 (2), R36 (2014).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat Rev Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Powell, E., et al. p53 deficiency linked to B cell translocation gene 2 (BTG2) loss enhances metastatic potential by promoting tumor growth in primary and metastatic sites in patient-derived xenograft (PDX) models of triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res. 18 (1), (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. , (2013).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
- Indumathi, S., et al. Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology. Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).
- Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias. Nat Commun. 6, 6927 (2015).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (67), e4260 (2012).
- Kang, Y. Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis. Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).
- Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).
- Lawson, D. A., et al. Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells. Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).
