Peptide-avledet Metode for å transportere gener og proteiner Across Cellular og Organellar Barrierer i Plants

Summary

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Abstract

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

Introduction

Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems¹. By the introduction of new genes, the plant’s own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine².

Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery³, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)⁴, and electroporation⁵ or polyethylene glycol⁶ treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results⁷. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates⁸. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.

Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer⁹. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.

Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy^10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes^15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic^18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria²¹ or plastids (chloroplasts)²² for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins²³ and either express (plasmid^21,24 or double-stranded DNA²⁵) or down-regulate (double-stranded RNA²⁶) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space^24-26 or within a specific organellar compartment²¹. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K₈) or polylysine-co-histidine (KH)₉ for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.

Protocol

1. Fremstilling av peptid-baserte formuleringer Fremstille stamløsninger av hvert peptid som følger: (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml eller 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) og (BP100) 2 K 8 (70 mm). Veie den nødvendige mengde av hvert peptid i et 1,5 ml mikrosentrifugerør og tilsett Autoclaved ultrarent vann for å oppløse peptidet. Bland godt ved gjentatt pipettering inntil det er oppnådd en klar oppløsning. Forsterke og rense plasmid DNA (pDNA), dobbelt-trådet DNA (dsDNA) og dobbelt-trådet RNA (dsRNA) i henhold til standard molekylære metoder. I 1,5 ml mikrosentrifugerør, lage stamløsninger med en konsentrasjon på 1 mg / ml (pDNA og dsDNA) eller 400 nM (dsRNA). Fremstille proteinstamoppløsning med en konsentrasjon på 7 um, ved oppløsning av 1 mg protein (f.eks., Alkohol dehydrogenase, ADH) pulver i 1 ml av natrium-karbonat-oppløsning (0,1 M, pH 9). Merk proteinet med fluorescent sonder som rhodamine B (RhB) i henhold til standard protokoller for å muliggjøre mikroskopisk visualisering av den leverte inn i celler protein. Kombiner de respektive komponentene i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. For peptid-pDNA formuleringer rettet mot cytoplasma, tilsett 6,4 mL (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) til 20 pl pDNA (1 mg / ml) og bland godt med pipettering. Tillat blandingen å stabilisere seg i 15 minutter ved 25 ° C. Legg 773.6 ul autoklaveres ultrarent vann for å fortynne løsningen til et sluttvolum på 800 ul. Bruk pDNA konstruksjon laget for atom uttrykk (P35S-RLuc-TNOs, tabell 1). For peptid-pDNA formuleringer rettet mot mitokondrier, tilsett 6,6 mL av Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) til 20 pl pDNA (1 mg / ml) og bland godt med pipettering. Tillat blandingen å stabilisere seg i 15 minutter ved 25 ° C og deretter legge til 2,4 mL av BP100 (1 mg / ml). Tillat blandingen å stabilisere seg i 15 minutter ved 256, C i ytterligere 15 min. Legg 771 ul autoklaveres ultrarent vann for å fortynne løsningen til et sluttvolum på 800 ul. Bruk pDNA konstruksjon laget for mitokondrie uttrykk (pDONR-cox2: rluc, tabell 1). For peptid-dsDNA-formuleringer, tilsett 5,1 mL av (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) i 8 pl av dsDNA (1 mg / ml) og bland godt ved pipettering. Tillat blandingen å stabilisere seg i 15 minutter ved 25 ° C. Legg 786.9 ul autoklaveres ultrarent vann for å fortynne løsningen til et sluttvolum på 800 ul. For peptid-dsrna formuleringer, tilsett 50 ul (KH) 9 -BP100 (800 nm) til 50 ul dsRNA (400 nM) og bland godt med pipettering. Tillat blandingen å stabilisere seg i 15 minutter ved 25 ° C. Legg 700 ul RNase-fritt vann for å fortynne løsningen til et sluttvolum på 800 ul. For peptid-protein formuleringer, tilsett 16 mL (BP100) 2 K 8 (70 mm) til 16 mL av ADH (7 mm) og blandgodt ved pipettering. Tillat blandingen å stabilisere seg i 15 minutter ved 25 ° C. Legg 768 ul autoklaveres ultrarent vann for å fortynne løsningen til et sluttvolum på 800 ul. Tillat formuleringene for å stabilisere i 15 min ved 25 ° C. 2. Karakterisering av Peptide-Based Formuleringer Overfør hver oppløsning (800 ul) i en kyvette for dynamisk lysspredning (DLS) analyse. Bestem den hydrodynamiske diameter og polydispersitetsindeks dannet komplekser med et zeta Nanosizer, ved anvendelse av en 633 nm He-Ne-laser ved 25 ° C med en tilbakespredningsdeteksjonsvinkel på 173 °. Følgende størrelsesmålinger, overfører hver løsning (800 pl) inn i et foldet kapillær celle for zeta-potensial målingene ved standardparameterne for dielektrisk konstant, brytningsindeks og viskositet av vann ved 25 ° C. Observere et lite volum av kompleks løsning, som brukes til DLS-analyse, ved atomkraftmikroskopi (AFM). Innskudd 10 ul kompleks løsning på det nylig eksponerte spaltet overflate av et ark glimmer og la glimmeret til å lufttørke over natten i en dekket petriskål av plast. Erverve et bilde av kompleksene i luft ved 25 ° C under anvendelse av en silisium cantilever med en fjærkonstant på 1,3 N / m i tappe-modus 27,28. 3. Infiltrasjon av anlegget blader Bruk tre uker gamle jord dyrket planter (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 eller poppel 26). Transfektere minst 3 blad for å tjene som triplikat for kvantifisering av genekspresjonen eller protein levering. Laster en 1 ml plast nålløs sprøyte med 100 ul kompleks løsning for transfeksjon av ett blad. Plasser tuppen av sprøyten på abaxial overflaten av bladet. Trykk på sprøytespissen mot bladet litt og trykke sprøytestempelet langsomt mens utøve et mottrykk med index finger av en latex-hansker hånd fra motsatt side. Vellykket infiltrering kan observeres som spredning av en vann-fuktet område i bladet. Label infiltrert blader for enkel identifisering. Inkuber transfekterte blad for optimaliserte varig følgende infiltrasjon med peptid-pDNA (12 timer), peptid-dsDNA (12 timer), peptid-dsRNA (9-48 timer) og peptid-protein (6 timer) formuleringer under følgende betingelser: 16 hr lys / 8 timers mørke ved 22 ° C for A. thaliana og poppel, eller 24 timers konstant lys ved 29 ° C i N. benthamiana. 4. Evaluering av Transfeksjon Efficiency Skjære hele transfektert blad av mindre anlegg (f.eks., A. thaliana) eller en 1 cm 2 delen av infiltrert regionen for større anlegg (f.eks., N. benthamiana). For transfeksjon eksperimenter med Renilla luciferase (Rluc) reporter vektor, bestemme transfection effektivitet kvantitativt ved hjelp av en Rluc Assay Kit. Plasser hver skåret blad eller blad-delen i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Tilsett 100 ul av 1 x Rluc Assay Lysis Buffer per rør. På samme måte, fremstille lysater av ikke-transfekterte kontrollblader (triplikate). Slipe bladet ved hjelp av en homogenisering støter og inkuber den resulterende løsningen ved 25 ° C i 6 – 10 timer. Sentrifuger løsningen ved 12 470 x g i en mikrosentrifuge i 1 min. Overføre 20 ul av det klarede lysat til en brønn i en 96-brønners mikroplate, og bruke den gjenværende volum for kvantifisering av totalprotein-konsentrasjon ved anvendelse av en BCA Protein Assay Kit ifølge produsentens protokoll. Tilsett 100 ul av 1 x Rluc Assay Substrate (fortynnet med Rluc Assay Buffer) inn i brønnen og bland ved langsom pipettering. Plasser mikro i en multimode mikroplateleser og starte målingen. Trekk bakgrunnen luminescens (gjennomsnitt av non-transfekterte tre eksemplarer) fra hver forsøks prøvens luminescens. Beregne forholdet photoluminescence (relative lysenheter, RLU) til mengden av protein (mg). For transfeksjon eksperimenter med grønt fluorescerende protein (GFP) reporter vektor eller fluorescensmerkede protein (f.eks., ADH-RhB), observere fluorescens ved hjelp av et konfokal laser scanning mikroskop. Skjær kantene av en hel blad (for å lette fjerning av luftrommene), mens et gjennomskåret blad kan brukes som den er. Fjern stempelet fra en 10 ml sprøyte, og plassere hver spaltet blad eller blad-delen i sprøyten. Skift stempelet og skyv den forsiktig til bunnen av sprøyten uten å knuse bladet. Trekke vann inn i sprøyten til den er omtrent halvfylt. Pek sprøyten oppover og skyv inn stempelet for å fjerne luft fra sprøyten gjennom spissen. Dekk til tuppen av sprøyten og trekk stempelet langsomt ned for å drive ut luft fra leaf. Gjenta denne prosessen flere ganger til bladet vises gjennomskinnelig. Dekke overflaten av et objektglass med tape. Skjær et firkantet område på båndet stor nok til bladet prøven ved hjelp av et blad, og skrelle firkantet stykke tape av med tang for å lage et prøvekammer. Tapen vil tjene som en spacer mellom lysbildet og dekk. Plasser bladet i kammeret med abaxial flaten vendt oppover og fylle den resterende kammer området med vann. Tett blad inne i kammeret med et dekkglass og feste kantene av dekkglass med tape. Undersøk blad prøven ved hjelp av konfokal laser scanning mikroskop under en 40X objektiv eller en 63X nedsenking i vann objektiv. GFP eller RhB fluorescens kan visualiseres ved eksitasjonsbølgelengdene av 488 nm eller 555 nm, henholdsvis.

Representative Results

En rekke nukleinsyre og protein last ble introdusert med hell i ulike planter ved hjelp av de utformede peptider som leverings vektorer. Elektrostatiske interaksjoner mellom kationiske peptider og negativt ladede last resulterte i dannelsen av transfeksjon komplekser som kan være direkte infiltrert inn i anlegget bladene ved hjelp av en nålløs sprøyte (figur 1). Optimaliserte formuleringer (empirisk bestemt i disse studiene 21,23-26) for transfeksjon av planteceller er oppført i tabell 1, hvor hver type det store omfanget av leverte last (pDNA, dsDNA, dsrna og protein) er representert. De midlere diametere på alle peptid-baserte formuleringer var i det tilnærmede område av 150 – 300 nm. Basert på DLS-analyse, alle formuleringer viste relativt lave størrelse polydispergerbarheter, noe som indikerer at de dannede peptid-last aggregater har en uniform størrelsesfordeling. Den morfologi avkomplekser mellom peptid og pDNA (figur 2A) eller protein (figur 2B), på glimmer, ble fotografert ved AFM. Homogene kulekomplekser ble observert for begge peptid-pDNA og peptid-protein kombinasjoner, i samråd med data fra DLS målinger. I forhold til zeta potensialet av komplekser (tabell 1), pDNA- og dsDNA-avledet komplekser hadde netto negative overflateladninger mens dsRNA-baserte komplekser hadde en nær-nøytralt overflateladning. Peptid-proteinkomplekser, på den annen side, ble positivt ladet. Effektiviteten hos peptid-pDNA og peptid-dsDNA-formuleringer i mediere transfeksjon av A. thaliana eller N. benthamiana som modell plantesystemer ble undersøkt kvantitativt og kvalitativt. Den RLuc genekspresjon assay ble anvendt for kvantifisering av genekspresjon nivåer (tabell 1), og derfor for dette eksperimentet pDNA ellerdsDNA som koder for RLuc gen må brukes for kompleksdannelse med de respektive bærerpeptider. Ved hjelp av (KH) 9 -BP100 / pDNA formulering, kjerne-målrettet levering og ekspresjon av pDNA kan oppnås, etter en inkubasjonstid på 12 timer, med en anslått RLU / mg verdi på omtrent 1 x 10 5. For mitokondrie-målrettet levering og ekspresjon av pDNA, en kombinasjon av peptider, Cytcox- (KH) 9 og BP100, er nødvendig for kompleksdannelse. Med samme optimalisert inkubasjonstid på 12 timer, imidlertid, et mye lavere nivå av transfeksjon (ca. 1 x 10 3 RLU / mg) ble nådd. I mellomtiden ble lignende Inkubasjonstiden (12 timer) og genuttrykk nivå (ca. 1 x 10 3 RLU / mg) påkrevd / registrert for dsDNA-baserte komplekser, også formulert med (KH) 9 -BP100 peptid. Kvalitative vurderinger av genuttrykk ble utført ved direkte mikroskopisk observasjon av bladene behandlet med komplekser FORBEREDELSERed hjelp pDNA eller dsDNA koding av GFP reporter genet. I celler transfektert med ikke-målrettede peptid-pDNA komplekser, diffus grønn fluorescens tilsvarende med GFP uttrykk ble klart observert og funnet å lokalisere i cytosol (figur 3A). Tydelige forskjeller i lokaliseringen mønster av GFP fluorescens var tydelig i celler infiltrert med mitokondrie-målrettet peptid-pDNA komplekser. Her, punktformet grønn fluorescens som colocalize med den mitokondrielle flekken ble synlig, noe som bekrefter spesifisiteten av genekspresjon utelukkende i den mitokondrielle rommet av celler (figur 3B). I tilfelle av peptid-proteinformuleringer, vil konjugasjon av proteinet last (ADH) til en fluorofor (RhB) muliggjøre visualisering av avgitt protein i det intracellulære rommet. Innen kort inkubasjonstid på seks timer ble ADH-RhB protein (blå) funnet å være fordelt over helecytosol og vakuole av infiltrerte celler (Figur 3C). I mellomtiden, kan rask og effektiv nedregulering av genekspresjon bli oppnådd på forskjellige planter ved hjelp av peptid-dsrna formuleringer. I det første forsøket ble A. thaliana blad infiltrert med peptid-dsRNA komplekser til taushet chalconet syntase gen (CHS) ansvarlig for anthocyanin (rød pigment) biosyntesen etter tørke. Forskjellen i utseende fra A. thaliana blader under normale (figur 3D, a) og tørke (figur 3D, b) gitt en enkel måte å evaluere CHS støydempere hjelp av optimalisert peptid-dsRNA formulering (pil 1 indikerer infiltrert region). I det andre eksperiment ble peptid-komplekser dsrna infiltrert i bladene av transgene A. thaliana som uttrykker gul fluorescerende protein (YFP). En tydelig reduksjon i YFP uttrykk kan sees i epidermal cellene 9 hr post-transfeksjon (figur 3E, F). Effektiviteten av formuleringen i å nedregulere genekspresjon i et annet plante-system (poppel, 12 timer etter transfeksjon) ble også bekreftet (figur 3G, H). Figur 1: Peptide-baserte Formuleringer for levering av nukleinsyre og Protein Lastene i levende planter. De designede bære peptider består av polykationene konjugert til celle penetrerende eller organellar transitt sekvenser. Polykationene muliggjør binding og / eller kondens av negativt ladde last samt flukt fra endosomal rommet følgende intern inn i cellene. Levering av last inn i celler og deretter til spesifikke organeller er mediert av celle penetrerende sekvenser og organellar transitt-sekvenser, respektivt. Ulike last som kan være successfully levert inn i anlegget omfatte nukleinsyrer som pDNA, dsDNA og dsRNA, samt modell proteiner som bovint serumalbumin (BSA), alkoholdehydrogenase (ADH) og citrine (en variant av gul fluorescerende protein). Bioaktive molekyler er i stand til å danne komplekser med transfeksjon peptidkonjugater via elektrostatiske interaksjoner, som er introdusert inn i planteblader ved hjelp av sprøyte infiltrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2: morfologier av peptid-baserte formuleringer. (A) AFM amplitude bilde av (KH) 9 -BP100 / pDNA formulering på N / P 0,5. (B) AFM høyde bilde av (BP100) 2 K 8 / ADH formuleringen ved molar Ratio 10. Gjengitt med tillatelse fra publiserte kilder 23,24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 3: Mikroskopisk Evaluering av transfeksjonseffektiviteter hjelp Optimaliserte Peptide-baserte formuleringer. (A) cytosoliske GFP uttrykk (grønn), tydelig atskilt fra kloroplast autofluorescence (rød), ble observert i svampete mesophyll cellene A. thaliana blader infiltrert med (KH) 9 -BP100 / pDNA formulering (N / P 0,5; 12 timer ). (B) GFP uttrykk (grønn) ble detektert i mitokondriene (rød) i de epidermale celler av A. thaliana blad infiltrert med Cytcox- (KH) 9 / BP100 / pDNA formulering (N / P 0,5 for hvert peptide; 12 timer). Forstørrede bilder av mitokondrier med GFP uttrykk vises i panelet til ytterste høyre. (C) Levering av ADH-RhB (blå) inn i svampaktig mesophyll cellene A. thaliana blader formidlet av (BP100) 2 K 8 på et peptid / protein molare forholdet 10, visualisert seks timer etter infiltrasjon. (D) A. thaliana blad før (a) og etter (b) behandling med (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molforhold 2; 48 timer), noe som resulterte i undertrykkelse av anthocyanin biosyntesebanen. En lignende formulering inneholdende GFP5 dsRNA ble infiltrert i bladet som negativ kontroll (c). Piler 1 og 3 indikerer den infiltrerte området mens pilene 2 og 4 angir de ikke-infiltrerte område innenfor bladet. (E) A. thaliana blader som uttrykker gul fluorescerende protein (YFP) og (F), redusert YFP fluorescens etter infiltrering med (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molforhold 2; 9 timer). (G) Transgene poppel bladene uttrykker gult fluorescerende protein (YFP) og (H) den reduserte YFP fluorescens følgende infiltrasjon med (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molar ratio 2; 12 timer). Gjengitt med tillatelse fra publiserte kilder 21,23,24,26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 4: Variasjon i Peptide-til-DNA (N / P) Ratio og effekten på Biofysiske Egenskaper av komplekser. Med økende peptid til DNA-forhold, peptid-baserte formuleringer avta i størrelse mens deres zeta-potensial verdier overgang fra negativ til positiv./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Tabell 1: Karakterisering og evaluering av ulike Peptid-baserte formuleringer. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen. Tabell 2: En sammenligning av peptid-baserte og andre Eksisterende DNA Levering Technologies for Intakte planter. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.

Discussion

Kritiske trinn i protokollen som er identifisert empirisk blir diskutert. Ved å sprøyte infiltrering, blir de peptid-baserte formuleringer ført inn i luftrommene inne i planteblad gjennom stomata. For å sikre maksimal opptak av oppløsningen, bør infiltrasjonsprosessen utføres når plantene er under betingelser som bidrar til stomatal åpning ie., Forsynt med nok vann og i løpet av den lyse perioden. Med hensyn til fremstillingen av transfeksjon komplekser, for formuleringer som omfatter en kombinasjon av to peptider (for mitokondrisk DNA-målrettet levering), er rekkefølgen for tilsetningen av hver komponent viktig og bør ikke være byttet om.

Det er mange plausible modifikasjoner i fremgangsmåten. Et annet alternativ for infiltrasjon av planteceller er bruken av vakuum-infiltrering, som er i stand til å innføre den komplekse oppløsning til hele planter og / eller partielle vev innbefattendeapikale meristemer. For denne alternative fremgangsmåten, blir frøplanter neddykket i transfeksjon oppløsning, og på grunnlag av det trykket som dannes av vakuum, blir de peptid-komplekser lasten tvinges gjennom stomata og inn i plantecellene (Yoshizumi, T., upubliserte data).

Transient genekspresjon, på grunnlag av undersøkelser med animalske celler, har vist seg å øke med høyere DNA-konsentrasjoner ^29-31. Det er viktig å merke seg at forholdet mellom peptid og DNA påvirker de biofysiske egenskaper (størrelse, overflateladning) av kompleksene (figur 4), som påvirker transfeksjonseffektiviteten; derfor må det optimale forholdet for å bli opprettholdt selv med økt DNA-konsentrasjon.

En av de viktigste fordeler ved å bruke peptider som et gen / protein-leveringsmiddel er at dens sekvens er mottagelig for innstiller for å oppfylle en ønsket funksjon. For eksempel, mitokondrie-målsøkende domene av bæreren peptid som er beskrevet i denne study kan erstattes med chloroplastic eller peroksisom-målsøkende sekvenser for lokalisering til disse organeller. Mens kloroplast transformasjon er mulig på flere anlegg ved hjelp av biolistics ^32-34, kunne hverken Agrobacterium heller biolistic metode innføre gener i mitokondriene eller andre organeller i tillegg til kjernen (tabell 2).

Det er ingen begrensninger stive vert toner for peptid-baserte transfeksjon, i motsetning til Agrobacterium-basert metode (tabell 2). Så langt formuleringer for transfeksjon av A. thaliana, N. benthamiana og poppel har blitt optimalisert (tabell 1), men fremgangsmåten kan også anvendes for tobakksplante, tomat sorten Micro-Tom, ris (basert på foreløpige eksperimenter), og andre mono- og dicotyledonous planter.

Så langt er det ingen kjent begrensning på transgenet størrelse når peptidene anvendes ens transfeksjon vektorer. I motsetning til dette har store DNA-molekyler som er funnet å redusere transformasjonen effektiviteten av Agrobacterium medierte metoder ^35,36, og en øvre størrelsesgrense for transgener på omtrent 200 kb er blitt rapportert ^37-39. Ved hjelp av biolistics, på den annen side store DNA-fragmenter kan bli skåret under fremstillingen eller levering inn i planter ^38. Selv om ingen øvre grense er bestemt for biolistic transformasjon så langt har fysiske begrensninger er funnet å begrense størrelsen av DNA som kan overføres til mye mindre enn 150 kb ^40. De største fordelene med å bruke peptid-basert system for genoverføring i forhold til eksisterende praksis som anvender enten Agrobacterium eller microprojectile-bombardement, omtalt ovenfor, er oppsummert i tabell 2.

Noen begrensninger finnes for denne metoden som det står. For det første, målrettet levering av pDNA til spesifikke organeller, slik som mitochondria, har vist seg mulig ved en enkel kombinasjon av DNA-binding, celle-organelle penetrerende og transitt-sekvenser, selv om effektiviteten var lav. Transgen ekspresjon kunne påvises ved konfokal mikroskopi, bare i en liten populasjon av mitokondrier i cellene. Derfor ytterligere modifikasjoner er nødvendig for å: (i) å forbedre den translokasjon av flere kompleksene gjennom celle / organellar membranen, og (ii) forbedre dissosiasjon og overføring av pDNA fra bæreren peptidet inn i målet organeller for ekspresjon. For det andre, ved hjelp av denne DNA-leveringssystem, den forbigående ekspresjon av eksogene rapportørgener er med hell oppnådd i det cytosoliske og mitokondrielle rommet av celler. Stabil inkorporering og ekspresjon av de innførte gener i planteatom / organellar genomet er ikke fastlagt ennå, men på grunn av fravær av egnede seleksjonsstrategier.

Erkjenner at det finnes områder for forbedring eller videre development, peptid-avledet strategi beskrevet her er fortsatt en enkel og allsidig teknikk som har banet vei for levering av ulike last inn ulike plantetyper.

Materials

(KH)9-BP100 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL
(BP100)2-K8 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK
BP100 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KKLFKKILKYL
Cytcox-(KH)9 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH
P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)
pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)
dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS)	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)
GFP5 siRNA	N/A	N/A	For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
CHS siRNA	N/A	N/A	For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
1 mL and 10 mL Plastic Syringes	TERUMO Corporation	SS-01T, SS-10ESZ
1.5 mL Microcentrifuge Tube	AS ONE Corporation	151212
96-Well Flat-Bottom Plate	Asahi Glass Co., Ltd.	3860-096
Adhesive Tape	Sekisui Chemical Co., Ltd.	No. 835
Alcohol Dehydrogenase	Sigma-Aldrich Co., LLC.	A-7011
Atomic Force Microscope	Seiko Instruments Inc.	SPI3800, SPA 300HV
Atomic Force Microscope	Hitachi High-Tech Science Corporation	AFM5300E
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.	23227
Cantilever	Hitachi High-Tech Science Corporation	K-A102001593
Confocal Laser Scanning Microscope	Carl Zeiss	LSM700
Cork Borer	Sigma-Aldrich Co., LLC.	Z165220	For excision of leaves into 1-cm diameter disks
Coverslip	Matsunami Glass Ind., Ltd.	C02261
Cuvette	Sarstedt	759116
Folded Capillary Cell	Malvern Instruments, Ltd.	DTS1070
Forceps	Shimizu Akira Inc.	Stainless pincet 150
Homogenization Pestle	Ieda Trading Corp.	9993
Mica	Nisshin EM Co., Ltd.	LC23Z
Microcentrifuge	Beckman Coulter	BKA46472
Microplate Reader	Molecular Devices Corporation	Spectra MAX M3
Microscope Slide	Matsunami Glass Ind., Ltd.	S011120
Pipette	Eppendorf Research® plus	3120000909
Pipette Tips	AS ONE Corporation	2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03
Plastic Petri Dish	AS ONE Corporation	1-7484-01
Renilla Luciferase Assay Kit	Promega corporation	E2810
Rhodamine B Isothiocyanate	Sigma-Aldrich Co., LLC.	283924
RNase-Free Water	Qiagen	129112
Sodium Carbonate	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	199-01585
Surgical Blade and Handle	FEATHER Safety Razor Co., Ltd.	Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle)
Syringe Tip Cap	Musashi Engineering Inc.	NC-3E
Weighing Balance	Sartorius	CPA225D
Zeta Potentiometer	Malvern Instruments, Ltd.	Zetasizer Nano-ZS