Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.
The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.
Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems1. By the introduction of new genes, the plant’s own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine2.
Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery3, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)4, and electroporation5 or polyethylene glycol6 treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results7. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates8. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.
Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer9. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.
Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria21 or plastids (chloroplasts)22 for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins23 and either express (plasmid21,24 or double-stranded DNA25) or down-regulate (double-stranded RNA26) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space24-26 or within a specific organellar compartment21. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K8) or polylysine-co-histidine (KH)9 for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול אשר זוהו באופן אמפירי נדונים. על ידי חדירת מזרק, הניסוחים מבוססי פפטיד המוכנסים הנאדיות בתוך עלה הצמח דרך הפיוניות. כדי להבטיח ספיגה מקסימלי של הפתרון, בתהליך החדיר צריכה להתבצע כאשר הצמחים נמצאים תחת תנאים שהם תורמים פתיחת הפיוניות כלומר., מסופקים עם מספיק מים ובתקופת האור. באשר להכנת מתחמי transfection, על ניסוחים שכוללים שילוב של שני פפטידים (למסירת DNA במיקוד המיטוכונדריה), הרצף עבור תוספת של כל רכיב חיוני ולא צריך להיות הפוך.
ישנם שינויים רבים סבירים לנוהל. אופציה נוספת עבור חדירת תאי צמח היא השימוש של חדירת אבק, אשר מסוגל להציג את הפתרון המורכב לתוך צמחים שלמים ו / או רקמות חלקיות כוללmeristems הפסגה. עבור הליך חלופה זו, שתילי שקועות הפתרון transfection, ובהתבסס על הלחץ שנוצר על ידי ואקום, מתחמי מטען הפפטיד נאלצים דרך הפיוניות ולתוך בתאי צמח (Yoshizumi, ט, נתונים שלא פורסמו).
ביטוי גני חלוף, בהתבסס על מחקרים באמצעות תאים מן החי, מוכיח להגדיל עם ריכוזי DNA גבוהים 29-31. חשוב לציין כי היחס של פפטיד ל- DNA משפיע על מאפייני biophysical (גודל, פריצת שטח) של מתחמים (איור 4), אשר משפיע יעילה transfection; ומכאן, היחס האופטימלי צריך להישמר גם עם ריכוז ה- DNA מוגבר.
אחד היתרונות העיקריים באמצעות פפטידים כסוכן למסירת גן / חלבון הוא כי הרצף שלה ניתן כוונון למלא תפקיד רצוי. לדוגמא, תחום מיקוד-המיטוכונדריה של הפפטיד המוביל מתואר הרבעה זוy יכול להיות מוחלף עם רצפים chloroplastic או peroxisomal מיקוד עבור לוקליזציה אברונים אלה. בעוד שתמורה הכלורופלסט אפשרי בכמה צמחים באמצעות biolistics 32-34, לא Agrobacterium ולא שיטת biolistic יכול להציג גנים לתוך המיטוכונדריה או אברונים אחרים מלבד גרעין (טבלה 2).
אין מגבלות מארח לטווח קשיחים transfection מבוססי פפטיד, בשונה משיטת מבוססי Agrobacterium (טבלה 2). עד כה, ניסוחים עבור transfection של thaliana א, נ benthamiana וצפצפה מוטבו (טבלה 1), אבל השיטה יכול להיות מיושם גם עבור טבק, זן עגבניות מיקרו-טום, אורז (מבוסס על ניסויים ראשוניים), וצמחים ובי-dicotyledonous אחרים.
נכון לעכשיו, אין שום מגבלה ידועה בגודל transgene כאשר פפטידים הם השתמשווקטורי transfection הים. לעומת זאת, מולקולות דנ"א גדולות נמצאו להפחית את יעילות השינוי של שיטות בתיווך Agrobacterium 35,36, ו מגבלת גודל עליון transgenes של כ 200 kb דווח 37-39. שימוש biolistics, מצד השני, קטעי דנ"א גדולים עשויים להיות טעונים במהלך הכנה או מסיר לתוך צמחי 38. אמנם אין גבול עליון נקבע לטרנספורמציה biolistic עד כה, אילוצים פיזיים נמצאו להגביל את הגודל של ה- DNA כי ניתן להעביר הרבה פחות מ -150 KB 40. היתרונות העיקריים של שימוש במערכת מבוססת-פפטיד עבור העברת גנים לעומת הגישות קיימות העסקה או Agrobacterium או הפגזת microprojectile, שנדונו לעיל, מסוכם בטבלה 2.
במוגבלות מעטיבשביל שיטה זו כפי שהיא עומדת. ראשית, ממוקד משלוח של pDNA כדי האברונים ספציפיים, כגון mitochondria, הוכח אפשרי על ידי שילוב פשוט של ה- DNA מחייבת חודר תאים רצפים במעבר אברון למרות היעילות הייתה נמוכה. הביטוי transgene ניתן היה לזהות, על ידי מיקרוסקופ confocal, רק אוכלוסייה קטנה של המיטוכונדריה בתוך התאים. לפיכך, שינויים נוספים נחוצים כדי: (i) לשפר את טרנסלוקציה של מתחמים יותר על פני התא / קרום organellar, וכן (ii) לשפר את הניתוק והעברת pDNA מן פפטיד המוביל לתוך אברון היעד לביטוי. שנית, באמצעות מערכת מסירת DNA זה, הביטוי החולף של גני כתב אקסוגניים הושג בהצלחה בתא cytosolic ו המיטוכונדריה של תאים. התאגדות וביטוי יציב של הגנים הציגו את הכור הגרעיני / הגנום organellar לא הוקמו עדיין, עם זאת, בשל העדר של אסטרטגיות בחירה מתאימות.
אף שהוא מודה כי ישנם אזורים לשיפור או ד נוסףevelopment, האסטרטגיה נגזרת פפטיד המתוארת כאן נשארת טכניקה פשוטה צדדית סללה את הדרך עבור משלוח מטענים שונים לסוגי צמח מגוונים.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות במימון מדע יפן וטכנולוגית סוכנות גישוש מחקר לטכנולוגיה מתקדמת (JST-Erato), האנרגיה החדשה התעשייתי טכנולוגית הפיתוח הארגוני (NEDO), וצלב-משרדי אסטרטגי חדשנות קידום התכנית (SIP), יפן .
(KH)9-BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL |
(BP100)2-K8 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK |
BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYL |
Cytcox-(KH)9 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH |
P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10) |
pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751) |
dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS) | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39) |
GFP5 siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
CHS siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
1 mL and 10 mL Plastic Syringes | TERUMO Corporation | SS-01T, SS-10ESZ | |
1.5 mL Microcentrifuge Tube | AS ONE Corporation | 151212 | |
96-Well Flat-Bottom Plate | Asahi Glass Co., Ltd. | 3860-096 | |
Adhesive Tape | Sekisui Chemical Co., Ltd. | No. 835 | |
Alcohol Dehydrogenase | Sigma-Aldrich Co., LLC. | A-7011 | |
Atomic Force Microscope | Seiko Instruments Inc. | SPI3800, SPA 300HV | |
Atomic Force Microscope | Hitachi High-Tech Science Corporation | AFM5300E | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | 23227 | |
Cantilever | Hitachi High-Tech Science Corporation | K-A102001593 | |
Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
Cork Borer | Sigma-Aldrich Co., LLC. | Z165220 | For excision of leaves into 1-cm diameter disks |
Coverslip | Matsunami Glass Ind., Ltd. | C02261 | |
Cuvette | Sarstedt | 759116 | |
Folded Capillary Cell | Malvern Instruments, Ltd. | DTS1070 | |
Forceps | Shimizu Akira Inc. | Stainless pincet 150 | |
Homogenization Pestle | Ieda Trading Corp. | 9993 | |
Mica | Nisshin EM Co., Ltd. | LC23Z | |
Microcentrifuge | Beckman Coulter | BKA46472 | |
Microplate Reader | Molecular Devices Corporation | Spectra MAX M3 | |
Microscope Slide | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S011120 | |
Pipette | Eppendorf Research® plus | 3120000909 | |
Pipette Tips | AS ONE Corporation | 2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03 | |
Plastic Petri Dish | AS ONE Corporation | 1-7484-01 | |
Renilla Luciferase Assay Kit | Promega corporation | E2810 | |
Rhodamine B Isothiocyanate | Sigma-Aldrich Co., LLC. | 283924 | |
RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
Sodium Carbonate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-01585 | |
Surgical Blade and Handle | FEATHER Safety Razor Co., Ltd. | Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle) | |
Syringe Tip Cap | Musashi Engineering Inc. | NC-3E | |
Weighing Balance | Sartorius | CPA225D | |
Zeta Potentiometer | Malvern Instruments, Ltd. | Zetasizer Nano-ZS |