Fósforo-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: uma ferramenta para medir<em> In Vivo</em> Capacidade mitocondrial fosforilação oxidativo no músculo esquelético humano

Summary

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (³¹PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Abstract

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (³¹PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo ³¹PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. ³¹PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for ³¹PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Introduction

O objetivo deste trabalho é apresentar um método reprodutível para medir de forma não invasiva in vivo a função mitocondrial do músculo esquelético em indivíduos que possuem uma ampla gama de habilidades. disfunção mitocondrial aberrante é uma indicação de uma ampla gama de síndromes metabólicas e doenças genéticas, a partir de condições comuns, tais como o envelhecimento e a diabetes de doenças raras tais como a ataxia de Friedreich.

Síndrome metabólica e disfunção mitocondrial

A síndrome metabólica foi mostrado para interromper a função mitocondrial, deprimir OXPHOS músculo esquelético, e levar ao armazenamento de lípidos ectópica em músculos esqueléticos ^{1, 2.} Organelas tão crítica que regulam a homeostase metabólica e energia, as mitocôndrias são implicados na fisiopatologia da obesidade ^{3, 4, 5} resistência à insulina </sup>, Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) ^{6, 7,} relacionada com a diabetes micro- ^{8, 9, 10, 11} e complicações macrovasculares ^{12, 13} e doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) ^{14, 15, 16,} entre outros .Insulin resistência é caracterizada por profundas mudanças na atividade mitocondrial do músculo esquelético, incluindo diminuição da taxa mitocondrial do ácido tricarboxílico (TCA) de fluxo, taxa de síntese de ATP e citrato sintase e NADH: O ₂ actividade de oxidoredutase ^5. Uma hipótese é que estas alterações pode ser devido à acumulação de ácidos gordos livres (FFA) metabólitos no músculo, que são marcadamente aumentada durante a obesidade e outras obesidade-rdoenças exaltados ^{2, 17.} A exposição de músculo de FFAs elevados e intermediários lipídicos podem diminuir a expressão de genes na via oxidativa lipídica, bem como o ciclo de TCA e de electrões da cadeia de transporte de carga (ETC) ^18. Esta redução de capacidade OXPHOS músculo esquelético mitocondrial na definição de uma sobrecarga lipídica é acompanhado por um declínio no quantitativa (conteúdo e biogênese das mitocôndrias) ¹⁹ e função qualitativa das mitocôndrias do músculo esquelético ^20. Expondo o músculo esquelético e os miócitos para FFAs conduz a resistência severa à insulina, e aumento da absorção de FFA no músculo é associado à resistência à insulina em humanos e roedores ^21. A ceramida intermediários lipídicos e diacilglicerol (DAG) foram mostrados para inibir directamente a via de sinalização de insulina, alterando a actividade de cinases, tais como a proteína-quinase C e Protein quinase B ^21. Consequentemente, as moléculas derivadas de lípidos parecem desempenhar um papel importante no desenvolvimento de resistência à insulina muscular esquelético e DMT2. No entanto, ainda não está claro se as mudanças na capacidade mitocondrial são uma causa ou uma consequência da resistência à insulina ^22.

Ataxia e Disfunção Mitocondrial de Friedrich

Diminuição OXPHOS também podem surgir de defeitos genéticos. Ataxia de Friedrich (FA), a forma mais comum de ataxia hereditária, é uma desordem genética causada por uma mutação no frataxin gene (FXN), resultando na acumulação de ferro intra-mitocondrial, a produção de espécies de oxigénio reactivo, e anomalias da fosforilação oxidativa ^{23, 24, 25, 26.} Esta importante descoberta conduziu ao desenvolvimento de terapias específicas, which objectivo de melhorar a função mitocondrial ao nível sub-celular. Apesar deste conhecimento, tem havido desenvolvimento limitada in vivo, os biomarcadores reprodutíveis para FA investigação clínica. Na verdade, uma barreira crítica na avaliação eficaz de terapias-alvo em FA é a incapacidade de acompanhar as mudanças na função mitocondrial. medidas funcionais atuais, por exemplo, pode identificar diminuição do débito cardíaco; no entanto, eles são incapazes de determinar o nível em que a disfunção ocorre (Figura 1). O desenvolvimento de um marcador fiável da função mitocondrial que pode ser utilizado para identificar e avaliar a progressão da doença na ataxia de Friedrich é crucial para avaliar o impacto mecânico relevante de terapias específicas.

OXPHOS prejudicada e disfunção cardíaca

função mitocondrial aberrante, adquirida ou genética, pode contribuir para o desenvolvimento ou progressão de cardidisfunção AC. Nas condições de sobrecarga de pressão e a insuficiência cardíaca, a energia primária preferência substrato interruptores de FFA em glicose. Isto é associado com diminuição da atividade ETC e fosforilação oxidativa ^27. A fisiopatologia do bioenergética mitocondrial na disfunção cardíaca pode ser diferente, consoante a origem primária da lesão mitocondrial. Diabetes e síndrome metabólica resulta em anormalidades mitocondriais em miocárdio, tais como biogênese prejudicada e metabolismo de ácidos graxos, que levam a flexibilidade reduzida substrato, a eficiência energética, e, eventualmente, disfunção diastólica ^{28, 29.} Em FA, por outro lado, uma deficiência resulta em acumulação frataxin ferro mitocondrial significativa em cardiomiócitos ^{30, 31.} Acumulação de ferro conduz à produção de radicais livres através da reacção de Fenton ^{32 <}/ Sup> e aumenta a chance de danos livre de cardiomiócitos induzida por radicais. Acúmulo de ferro intra-mitocondrial está também associada a um aumento da sensibilidade ao estresse oxidativo e uma capacidade oxidativa reduzida ^{30, 31.} Acúmulo de ferro e subsequente função mitocondrial aberrante, devido à deficiência de frataxina, pode, portanto, ser responsável por a energética cardíaca comprometida e cardiomiopatia observadas na FA ^{33, 34.} É também interessante notar que a capacidade oxidativa reduzida em mitocôndrias do músculo esquelético é paralela à intolerância ao exercício e a redução da capacidade metabólica na insuficiência cardíaca (HF) ^35. Medição da capacidade OXPHOS músculo esquelético, tal como aqui descrito, é facilmente implementável e robusto; juntamente com o significado da OXPHOS músculo esquelético em HF, estas características fazem dele um biomarcador atraente em estudos abrangentes de ouvirdoença de t ^36.

OXPHOS prejudicada ea disfunção cardíaca que o acompanha não é um aspecto inconsequente de metabólica e doença mitocondrial. Indivíduos com diabetes e doença metabólica estão em maior risco de desenvolver doença cardiovascular e têm excesso de mortalidade após infarto do miocárdio (MI) ^{37, 38, 39, 40, 41;} mais da metade dos indivíduos FA tem cardiomiopatia, e muitos morrem de arritmia cardíaca ou insuficiência cardíaca ^42. Assim, a quantificação de OXPHOS reduzida não só poderia permitir a detecção e tratamento da disfunção cardíaca precoce, mas ele também pode aliviar um fardo clínico importante nestas doenças.

terapias direcionadas para aumentar diretamente a capacidade OXPHOS é uma área promissora para melhorar o tratamento de assuntos, wheterap a causa de disfunção metabólica é genética ou adquirida. Actualmente, o desenvolvimento de novas drogas que aliviam tanto a função mitocondrial anormal ⁴³ ou corrigir o defeito genético primário ⁴⁴ pode melhorar a característica bioenergética demente de FA alvo. No caso de disfunção mitocondrial adquirida, o aumento da actividade física pode melhorar a função mitocondrial ^{45, 46, 47.}

³¹ Fósforo espectroscopia de ressonância magnética como biomarcador não invasivo da função mitocondrial

Independentemente da terapia testada, uma integrada na avaliação in vivo da bioenergética do músculo esquelético é uma ferramenta fundamental para avaliar o impacto das intervenções dirigidas, especialmente em indivíduos com intolerância ao exercício grave ou incapacidade de se submeter metabo convencionaltestes lic. Espectroscopia de ressonância magnética sintonizado de fósforo ⁽³¹ PMRS), um núcleo endógena encontrado em vários substratos de alta energia no interior das células em todo o corpo, tem sido utilizada para quantificar a capacidade oxidativa mitocondrial usando uma variedade de abordagens, incluindo em-íman protocolos de exercício de recuperação e estimulação muscular protocolos ^48. Os protocolos de exercícios de recuperação dependem de uma variedade de aparelhos que variam em complexidade de ergômetros MRI-compatíveis que regulam e medir carga de trabalho para simples configurações de correias e almofadas permitindo tipo explosão resistiva e exercício quase estático. Um dos principais objetivos de qualquer um destes protocolos é produzir um desequilíbrio de energia para os quais a demanda por trifosfato de adenosina (ATP) é inicialmente recebida através da quebra enzimática da fosfocreatina (PCr), através da creatina quinase reacção ^49. Após interrupção do exercício, a taxa de produção de ATP é dominado por Pho oxidativosphorylation e representa o máximo de capacidade in vivo das mitocôndrias ^50. Além disso, OXPHOS durante a recuperação pós-exercício pode ser descrita por uma reação velocidade de primeira ordem ^51. A recuperação pós-exercício da PCr pode, portanto, ser quantificada pela instalação de uma constante de tempo exponencial (τ _PCr), com menores valores de τ _PCr representando maior capacidade para a síntese de ATP oxidativo. Esforços significativos foram feitos para validar ³¹ PMRS contra ex vivo e medidas mais diretas de OXPHOS e demonstrar o potencial de aplicabilidade clínica desta técnica ^{52, 53, 54, 55.}

Notavelmente, o protocolo descrito no presente trabalho pode ser implementado em scanners clinicamente disponíveis, e isto tem sido amplamente validado como um biomarcador não invasivo Ofunção mitocondrial f ^56. No entanto, um protocolo PMRS exercício ³¹ otimizado para aplicação em indivíduos com diferentes gravidades do comprometimento neuromuscular ou mobilidade não tem sido bem estabelecida ^57. Um bem definida, protocolo de exercício amplamente aplicável e ³¹ PMRS técnica seria particularmente útil na avaliação de doenças com alterações fundamentais na função mitocondrial.

Vários estudos anteriores têm explorado as aplicações de técnicas não invasivas para quantificar a função mitocondrial em indivíduos. Por exemplo, estas técnicas têm mostrado OXPHOS alterada em indivíduos com diabetes tipo 2 ^36. Lodi et ai. primeiro testada a viabilidade das técnicas PMRs em indivíduos com FA e verificou que 1) o defeito genético fundamental na FA prejudica OXPHOS músculo esquelético e 2) o número de tripleto GAA repete é inversamente proporcional ao músculo esquelético óXPHOS ^33. Mais recentemente, Nachbauer et ai. PMRS usado como uma medida de desfecho secundário em um teste de drogas FA com 7 indivíduos. PCr tempos de recuperação foram significativamente mais longa em indivíduos em relação aos controles, reafirmando trabalho anterior de Lodi e indicando que os efeitos da expressão aberrante frataxin em FA pode resultar em um declínio na capacidade mitocondrial que é detectável através de técnicas PMRs ^58.

Métodos confiáveis para definir adequadamente em função do músculo esquelético vivo em um, o custo-benefício, e de maneira reprodutível viável são fundamentais para melhorar os resultados dos pacientes em uma série de doenças que afetam a função mitocondrial.

Este trabalho descreve um procedimento robusto para a obtenção da capacidade oxidativa máxima vivo do músculo esquelético usando ³¹ PMRS. O protocolo de exercício de imã em é bem tolerado por indivíduos que abrangem uma ampla gama de física e functional habilidades e oferece uma configuração simplificada assunto usando o equipamento barato e amplamente disponível.

Protocol

Este protocolo é aprovado pelo e segue as diretrizes da Ohio State University Institutional Review Board para a investigação seres humanos. É extremamente importante que todos os procedimentos que envolvem equipamentos MR são realizadas por pessoal com formação adequada que aderiram aos mais altos padrões de segurança MR 59. 1. Materiais e Preparação Certifique-se de que todos os materiais necessários estão disponíveis antes do experime…

Representative Results

Estudo reprodutibilidade Seis voluntários (4 homens e 2 mulheres, idade média: 24,5 ± 6,2 anos) com nenhum coração auto-reportados, metabólica ou doença mitocondrial foram submetidos a sessões do exercício técnica e de imagem 31 PMRS descrito em 2 dias diferentes dentro de 1 semana para avaliar técnica reprodutibilidade (Figura 6a). Os estudos realizados em voluntários n…

Discussion

Este documento descreve um protocolo padrão para ³¹ PMRS exame que permite a medição de série e não-invasivo in vivo da função mitocondrial do músculo esquelético. O protocolo mantém apelo considerável quando se considera a amplitude das investigações que visam a crescente carga de síndrome metabólica e sua morbidade e mortalidade resultante. Este protocolo ³¹ PMRS requer uma quantidade mínima de tempo scanner e pode ser incorporado em investigações metabólicas abrangent…

Materials

1.5 T MR Scanner	Siemens		manufacturer will not affect results
10 cm 31P transmit-receive coil, 1.5T compatible	PulseTeq		manufacturer will not affect results
3 fl oz Baby Oil	Johnson & Johnson		manufacturer will not affect results
Foam triangle cushion (Knee)	Siemens		manufacturer will not affect results
(3) plastic buckle resistive straps; table to table	Siemens		manufacturer will not affect results
(1) plastic buckle resistive strap; self-connecting	Siemens