Nella malattia di Parkinson (PD), sostanza nera (SNC) neuroni dopaminergici degenerano, portando ad una disfunzione del motore. Qui riportiamo un protocollo per la coltura di neuroni del mesencefalo ventrale da un topo che esprime eGFP guidata da una sequenza promotore la tirosina idrossilasi (TH), la raccolta neuroni fluorescenti singoli dalle culture, e misurando il loro trascrittoma utilizzando RNA-Seq.
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Articolo metodologico
Identificazione affidabile di vita neuroni dopaminergici in Culture Midbrain Utilizzando RNA Sequencing e TH-promotore-driven eGFP Expression
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nella malattia di Parkinson (PD) non vi è perdita neuronale diffusa in tutto il cervello con degenerazione dei neuroni dopaminergici pronunciata nel snc, che porta a bradicinesia, rigidità, e tremore. L'identificazione dei neuroni dopaminergici che vivono in colture primarie ventrale mesencefalica (VM) utilizzando un marcatore fluorescente fornisce un modo alternativo per studiare la vulnerabilità selettiva di questi neuroni senza fare affidamento sul immunocolorazione delle cellule fissate. Qui, isolare, dissociamo, e la cultura di topo neuroni VM per 3 settimane. Abbiamo poi identifichiamo neuroni dopaminergici nella coltura usando eGFP fluorescenza (guidata da un promotore tirosina idrossilasi (TH)). neuroni individuali sono raccolte in provette da microcentrifuga utilizzando micropipette di vetro. Successivamente, abbiamo la lisi delle cellule raccolte, e condurre la sintesi del DNA e trasposoni-mediata "tagmentation" per produrre librerie di RNA-Seq singola cella 1, 2,ass = "xref"> 3, 4, 5. Dopo aver superato un controllo di qualità-controllo, librerie unicellulari sono in sequenza e la successiva analisi viene effettuata per misurare l'espressione genica. Riportiamo i risultati trascrittoma per dopaminergici individuale e neuroni GABAergici isolati da colture mesencefalo. Si segnala che il 100% delle cellule vive TH-eGFP che sono stati raccolti e sequenziati erano neuroni dopaminergici. Queste tecniche avranno applicazioni diffuse nel campo delle neuroscienze e della biologia molecolare.
Introduzione
La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa incurabile, legate all'età. La causa di questo disturbo relativamente comune rimane poco compresa. Vi è diffusa perdita neuronale in tutto il cervello, con marcata degenerazione neuronale dei neuroni dopaminergici nella sostanza nera (SNC), che porta a caratteristiche cliniche diagnostiche di bradicinesia, rigidità e tremori.
colture miste primarie contenenti neuroni dopaminergici SNC sono particolarmente rilevanti per la malattia di Parkinson. Ventrale tegmentale Area (VTA) neuroni dopaminergici sono stati implicati nella ricompensa e la dipendenza. Ventrale mesencefalico....
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Protocollo
NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida per la cura e l'uso di animali forniti dal National Institutes of Health, e protocolli sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso il California Institute of Technology.
1. Derivazione di primaria dopaminergici colture cellulari da Brain embrionali di topo
- Soluzioni e terreno di coltura
- Preparazione di Acido Ascorbico della Soluzione
- Pesare 352 mg di acido ascorbico. Aggiungere sterile H 2 O per un volume totale finale di 20 mL. Posto nel 37 ° C bagnomaria per sciogliere. Filtr....
- Preparazione di Acido Ascorbico della Soluzione
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Risultati
Qui riportiamo un protocollo per la coltura neuroni del mesencefalo ventrale da un topo che esprime eGFP guidata da una sequenza promotrice tirosina idrossilasi, raccolta neuroni fluorescenti singoli dalle culture, e misurando la loro trascrittoma RNA utilizzando RNA-seq (Figura 1). I dati mostrano che il 100% delle cellule TH-eGFP-positivi che sono stati raccolti e sequenziati erano neuroni dopaminergici, basata sulla presenza delle seguenti tre trascritti genici DA-cor.......
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Discussione
Qui si isolare le cellule singole da una popolazione eterogenea con un tag fluorescenti, quindi studiare ogni cella con cella singola RNA-Seq. Si segnala che il 100% delle cellule vive TH-eGFP che abbiamo raccolto e sequenziati erano neuroni dopaminergici infatti, basata sulla presenza delle seguenti tre trascritti genici DA-correlati, TH, DDC e slc6a3. Tutte le cellule positive TH-eGFP espresso questi tre geni come valutato dal RNA-Seq. Questo è stato concorde con gli studi elettrofisiologici che hanno dimostrato che o.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health degli Stati Uniti (DA017279, AG033954, DA037743), della Michael J. Fox Foundation e della Caltech Innovation Initiative che finanzia il Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory presso il California Institute of Technology. Ringraziamo Brian Williams per aver ottimizzato il protocollo della libreria RNA-Seq e per l'assistenza fornita. Ringraziamo Henry Amrhein per la formazione computazionale. Ringraziamo Barbara J. Wold per l'uso della sua attrezzatura e dello spazio del laboratorio. Ringraziamo Igor Antoshechkin per il sequenziamento della biblioteca e per la gestione ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | ||
| Soluzione salina bilanciata con matasse (HBSS), 1x | Gibco | 14175-095 | |
| Siero equino da donatore | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Terreno neurobasale | Gibco | 21103-049 | |
| Terreni di coltura che contengono una forma stabilizzata di L-glutammina, L-alanil-L-glutammina: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | Concentrazione finale di 0,5 mM. |
| Acido L-Ascorbico | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x soluzione madre, 1x concentrazione finale. |
| Piatti con fondo in vetro da 35 mm | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poli-L-Ornitina | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Immagazzinato a -20 ° C su 20 µ L aliquote |
| Desossiribonucleasi I (DNase) | Sigma | blu DN25 | |
| P1000 | Sorenson Bioscience | Inc. 10130 | |
| Piastra di Petri poco profonda da 10 mm | VWR | 25384-324 | |
| 37 C Bagnomaria | |||
| 37 gradi C, incubatore | |||
| 16% paraformaldeide (PFA) | Scienze della microscopia elettronica | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Siero d'asino | Equitech | SD-0100HI | Soluzione madre al 100%, concentrazione finale all'1%. |
| Forbici chirurgiche standard Fine | Science Tools | 14000-14 | |
| Pinze - 2x3 denti | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Pinze - Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Pinze - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Soluzione tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | Ago da 500 mL |
| 21 G | Ago BD PrecisionGlide 305167 | 100 aghi Estrattore | |
| micropipette | Strumento Sutter | modello P-87 | |
| Micromanipolatore | Strumento Sutter | Kit di sequenziamento MP-285 | |
| : Kit SMARTer Ultra Low RNA per il sequenziamento Illumina | Clontech | 634936 | 100 rnxs, incluso il kit Advantage2PCR |
| oligonucleotide (12 &; micro; M): L'oligonucleotide SMARTer IIA (12 µ M) | Dal kit SMARTer | ||
| Trascrittasi inversa (100 unità) | inversa SMARTcribe | dal kit SMARTer | |
| Innesco 1 | 3' Primer CDSIIa | Dal kit SMARTer | |
| Primer 2 | primer IS PCR | Dal kit SMARTer | |
| 50x 2 miscela di polimerasi | 50x Advantage 2 miscela di polimerasi | Dal kit SMARTer | |
| Kit di preparazione del campione di DNA | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 campioni |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | Dal kit Nextera | |
| Cocktail di primer PCR (PPC) | Cocktail di primer PCR Nextera (PPC) | Dal kit Nextera | |
| Fluorimetro | Il kit Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer | Agilent | 5067-4626 | 110 rxns |
| Sistema di elettroforesi | Bioanalizzatore Agilent 2100. | G2938C | |
| Perline magnetiche: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
| Salviette RNAse: Salviette RNAse Zap | Ambion | AM9786 | Dimensione 100 fogli |
| Qubit ds HS Kit di analisi | Sonde molecolari | Q32854 | 500 saggi |
| Kit di estrazione su gel: Kit di estrazione su gel Qiaquick | Qiagen | 28704 | |
| Tubo capillare in vetro | (Kimax-51, 1,5 - 1,8 mm di diametro esterno) | ||
| Microforge | Narishige (o equivalente) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tirosina idrossilasi-eGFP ceppo di topo | Codice MMRRC: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Centro di ricerca regionale per topi mutanti |
Riferimenti
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and ....
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Ristampe e permessi
