Summary
Bij de ziekte van Parkinson (PD), substantia nigra (SNC) dopaminerge neuronen degenereren, waardoor motorische stoornissen. Hier melden wij een protocol voor het kweken van ventrale middenhersenen neuronen van een muis tot expressie eGFP gedreven door een tyrosine hydroxylase (TH) promotor sequentie, het oogsten van individuele fluorescerende neuronen uit de culturen, en het meten van hun transcriptoom met behulp van RNA-seq.
Abstract
Bij de ziekte van Parkinson (PD) is wijdverbreid neuronaal verlies gehele hersenen met uitgesproken degeneratie van dopaminerge neuronen in de SNC waardoor bradykinesie, rigiditeit en tremor. De identificatie van levende dopaminerge neuronen in primaire ventrale mesencefale (VM) kweken met een fluorescente merker verschaft een alternatieve manier om de selectieve kwetsbaarheid van deze neuronen te bestuderen zonder te vertrouwen op de immunokleuring van gefixeerde cellen. Hier hebben we te isoleren, distantiëren en cultuur muis VM neuronen gedurende 3 weken. Vervolgens identificeren dopaminerge neuronen in de kweken met behulp eGFP fluorescentie (aangedreven door een tyrosine hydroxylase (TH) promoter). Individuele neuronen worden geoogst in microcentrifugebuizen met behulp van glas micropipetten. Vervolgens hebben we lyseren de geoogste cellen, en gedrag cDNA synthese en transposon-gemedieerde "tagmentation" om enkele cel RNA-Seq bibliotheken 1, 2 te produceren,ass = "xref"> 3, 4, 5. Na het passeren van een kwaliteitscontrole check, zijn eencellige bibliotheken gesequenced en de daaropvolgende analyse wordt uitgevoerd om de genexpressie te meten. rapporteren we transcriptoom resultaten voor de afzonderlijke dopaminerge en GABA-erge neuronen geïsoleerd van middenhersenen culturen. Wij rapporteren dat 100% van de levende TH-eGFP cellen die werden geoogst en gesequenced waren dopaminerge neuronen. Deze technieken zullen wijdverspreide toepassingen in de neurowetenschappen en moleculaire biologie.
Introduction
Ziekte van Parkinson (PD) is een ongeneeslijke, leeftijdsgebonden neurodegeneratieve aandoening. De oorzaak van deze relatief veel voorkomende aandoening blijft slecht begrepen. Er is wijdverbreid neuronaal verlies over de hersenen, met een uitgesproken neuronale degeneratie van dopaminerge neuronen in de substantia nigra (SNC) waardoor kenmerkende klinische kenmerken van bradykinesie, stijfheid en tremor.
Primaire gemengde kweken die SNc dopaminerge neuronen vooral relevant voor de ziekte van Parkinson. Ventrale tegmental Area (VTA) dopaminerge neuronen zijn betrokken bij beloning en verslaving. Ventrale mesencefale (VM) primaire gemengde embryonale culturen bevatten zowel SNc en VTA dopaminerge (DA) neuronen en GABA-erge neuronen. VM primaire kweken kan nuttig zijn voor neuroprotectie assays en de selectieve kwetsbaarheid van dopaminerge neuronen helderen. Er is geen betrouwbare manier om dopaminerge cellen in kweek op basis van morfologie te identificeren. Hijre ontwikkelen we technieken te identificeren en te oogsten enkele dopaminerge neuronen, en de bouw van single-cell, high-yield RNA sequencing bibliotheken.
Wij rapporteren representatieve RNA transcriptoom data voor alleenstaande dopaminerge en GABA-erge neuronen geïsoleerd van middenhersenen culturen. Dit protocol kan worden gebruikt voor neuroprotectie, neurodegeneratie en farmacologische assays om het effect van diverse behandelingen op de DA / GABA transcriptoom studie. Omdat dopaminerge neuronen vormen een kleine minderheid van de neuronen uitgedrukt in primaire kweken VM, zal het vermogen om deze neuronen in levende culturen betrouwbaar te identificeren een verbeterde reeks eencellige studies inschakelen. Deze nieuwe technieken zullen vooruitgang in het begrip van de mechanismen die plaatsvinden op cellulair niveau te vergemakkelijken en kunnen toepassingen elders op het gebied van neurowetenschappen en moleculaire biologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor verzorging en gebruik van dieren die door de National Institutes of Health, en protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan het California Institute of Technology.
1. Afleiding van primaire dopaminerge celkweken uit embryonale muizenhersenen
- Oplossingen en Cultuur Medium
- Bereiding van Ascorbinezuur voorraadoplossing
- Weeg 352 mg ascorbinezuur. Voeg steriel H 2 O tot een totaal eindvolume van 20 ml. Plaats in 37 ° C waterbad op te lossen. Filteren door middel van 0,2 um spuit tip en op te slaan in 500 ul fracties bij -20 ° C.
- Bereiding van Papaïne voorraadoplossing
- Verdun papaïne tot 15 eenheden / ml in 1 x Hanks'-gebalanceerde zoutoplossing (HBSS). Pipet op en neer 5 keer om goed te mengen. Voor te bereiden op de dag van dissectie.
- Bereiding van DNase voorraadoplossing
- Weeg 20 mg DNase. Voeg steriel H2O tot een totaal eindvolume van 20 ml. Steriel filter met 0,2 um spuitfilter tip. Bewaar bij -20 ° C in 1 ml porties.
- Bereiding stopoplossing
- Verdun 5 ml donor paard paarden serum tot 10% in 45 ml 1x HBSS. Steriel filter met een 0,2 um spuitfilter tip. Bewaren bij 4 ° C.
- Bereiding van 4% runderserumalbumine (BSA) voorraadoplossing
- Weeg 2 g BSA en 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan een totaal eindvolume van 45 ml. Filter steriliseren met 0,2 um spuitfilter tip. Bewaren bij 4 ° C.
- Voorbereiding van de Plating Medium
- In 494 ml medium, voeg 1,25 ml kweekmedium dat L-alanyl-L-glutamine (een gestabiliseerde bron van L-glutamine) en 5 ml donor paarden serum bevat. Filter steriliseren met 0,2 urn spuit filter tip. Bewaren bij 4 ° C.
- Bereiding van celkweekmedium
- In 196 ml plating medium, voeg 4 mL B27 en 200 pi ascorbinezuur. Filter steriliseren met 0,2 urn filter. Bewaar de oplossing bij 4 ° C en binnen een week.
- Bereiding van 4% paraformaldehyde (PFA) Oplossing
Let op: Algemene voorzorgsmaatregelen voor het gebruik van paraformaldehyd zijn als volgt: Gebruik een zuurkast, vermijd de huid en contact met de ogen, vermijd inademing van de dampen, uit de buurt van hitte of open vuur. Draag geschikte persoonlijke beschermende kleding. PFA kan sensibilisatie en dermatitis veroorzaken, dan was uw handen grondig wassen.- Voeg 10 ml 16% PFA tot 30 ml 1x PBS, pH 7,4.
- Bereiding van 0,1% Triton X-100
- Pipetteer 1 ml Triton X-100 in 9 ml 1x PBS tot een 10% oplossing. Pipet langzaam te laten viskeuze oplossing pipet tip vullen. Warm in 37 ° C waterbad tot dislossen. Bewaar 10% voorraad bij 4 ° C.
- Verdun 10% aandelen tot 0,01% (bijvoorbeeld door het uitvoeren van 2 seriële verdunningen 1:10: verdun 1 ml 10% oplossing in 9 ml 1x PBS tot 1% oplossing te maken, 1 ml 1% oplossing in 9 mL 1 x PBS om 0,1% oplossing).
- Bereiding van 10% en 1% donkey serum
- Voeg 1 ml donkey serum 9 ml 1x PBS gedurende een 10% oplossing. Voeg 0,5 ml donkey serum 49,5 ml 1x PBS, pH 7,4 voor een 1% oplossing.
- Bereiding van 1x PBS
- Verdun 10x PBS tot 1x door toevoeging van 50 ml in 450 ml H2O Stel de pH van de oplossing op pH 7,4 met behulp van een pH meter.
- Bereiding van Ascorbinezuur voorraadoplossing
- Het bekleden van de Culture Dishes
- Poly-L-Ornithine Coating
- Coat alleen de 10 mm diameter glazen bodem in het midden van de 35 mm schalen met 120 pl poly-L-ornithine met steriele techniek. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Gebruik een vacuüm aspirator de poly-Lo zuigenrnithine. Spoel de gerechten tweemaal met steriele H 2 O.
- Laminine Coating (stock concentratie van 1 mg / ml)
- Verdun 20 ul laminine met 2 ml steriele H 2 O (eindconcentratie 0,01 mg / ml).
- Coat alleen de 10 mm diameter glazen bodem in het midden van de gerechten met 120 pi van laminine verdund tot 0,01 mg / ml met steriele techniek en incubeer gedurende 1 uur of O / N bij 37 ° C vóór gebruik.
- Poly-L-Ornithine Coating
- muis Dissection
Opmerking: De methoden van deze dissectie zijn ontworpen voor minimale blootstelling van cellen, worden overgedragen uit embryonale zakken naar de incubator. De levensvatbaarheid van de cellen behouden blijft door het verwijderen van slechts een gedeelte van de hersenen dissectie van de middenhersenen. Isolatie van de middenhersenen verloopt sneller zonder dat de gehele hersenen om de regio ontleden. Zie Tabel Materialen voor de muizenstam gebruikt in deze studie. - Spray de buik van het inslapen muis met 70% ethanol. Pak de huid van de onderbuik behulp van een tang met 2 x 3 tanden en open de buikholte behulp bot mes chirurgische schaar. Maak twee sneden bewegen zijdelings en proximaal aan elke kant. Vouw over de buikwand met behulp van een tang om de buikholte bloot te leggen.
OPMERKING: De baarmoeder wordt nu bloot. Blootstellen van de borstholte en de creatie van pneumothorax zorgt er ook voor dat het dier niet terug te vorderen. - Snijd beide uiteinden van de baarmoeder hoorn naar de baarmoeder scheiden. Plaats in een petrischaal in een steriele kap.
- Het gebruik van rechte-tip pincet in elke hand open de embryo zak en verwijder het embryo. Snel onthoofden door knijpen hoofd uit bij de hals met de tang. Stabiliseren het hoofd met de tang stevig op de snuit geplaatst, zodat het dorsale oppervlak toegankelijk.
- Behulp van de tang die in de andere hand, knijp de laag van de huid en de schedel net voor de nok van het mesencephalon. Trek de huid en de schedel caudaal langs de middellijn. Plaats tang rond de kam met een tip tussen de cortex en mesencephalon en de andere over het cerebellum.
- Knijpen en verwijder de gehele middenhersenen, met achterlating van de voorhersenen op de rostrale kant en cerebellum aan de caudale kant. Plaats in een petrischaal met koude HBSS onder een stereomicroscoop.
- Herhaal de procedure voor de resterende embryo's.
- Onder de microscoop ontleden, flip-over het brein segment, zodat de buikzijde is nu toegankelijk. Er zijn nu 4 kwadranten zichtbaar. Verwijderen van de hersenvliezen en bloedvaten door voorzichtig grijpen de hersenvliezen en omhoog te trekken weg van de hersenen.
- Gebruik een tang om de hersenen segment te stabiliseren, terwijl het scheiden van de middenhersenen. Plaats een tong pincetten in de ventrikel ongeveer in het midden van het segment. Maak de eerste pinch dorsaal, wijzend into de schotel, dan mediaal aan elke kant. Neem de onderste twee kwadranten door het maken van laterale snijdt aan beide kanten.
LET OP: Het weefsel van belang is in het ventrale inferieure sectie, die dichte verschijnt. Deze regio bevat zowel de VTA en SNC. - Trim en het weefsel dat is minder dicht weggooien: dit omvat de superieure en inferieure colliculi. Plaats de ontleed weefsel die zowel de VTA en SNc in verse HBSS op een apart deel van de petrischaal.
Opmerking: In deze fase van muizenhersenen ontwikkeling (E14), wordt het gebied van belang in de ventrale middenhersenen gescheiden door een ventrikel van de zona incerta en andere hypothalamus celgroepen. Hoe meer lange structuur van de ontwikkeling van embryonale muizenhersenen maakt het onderscheid tussen deze gebieden, die dichter bij elkaar liggen in het volwassen muizenhersenen. - Herhaal dit voor alle resterende hersenen segmenten.
- Immers de hersenen segmenten zijn ontleed, een tang en een No. 11 scalpel tot kwartaal each middenhersenen deel in stukken van ongeveer gelijke grootte.
- Enzymatische behandeling van cellen
- Gebruik een breed-boring P1000 pipetpunt tot het nemen van alle gevierendeeld middenhersenen segmenten in de HBSS en leg ze in een 15 ml conische buis. Laat de segmenten naar de bodem van de buis en verwijder HBSS die heeft opgenomen met de in vieren delen.
- Voeg 500 ul van papaïne oplossing aan de buis en plaats in een 37 ° C waterbad gedurende 15 minuten. Resuspendeer cellen door vinger flicking de buis na 7,5 min.
- Met behulp van een breed boring P1000 tip, pipet alleen de middenhersenen segmenten in een 1 ml portie van deoxyribonuclease I (DNase) oplossing. Laat de segmenten naar de bodem van de buis.
- Met een brede boring P1000 tip, alleen overdragen de middenhersenen segmenten een 15 ml buis met 1 ml koud stopoplossing te spoelen. Laat de segmenten naar de bodem van de buis en herhaal de spoeling opce meer.
- Mechanische Wrijven celsuspensie
- Vervang de laatste spoelen met 1 ml vers stop-oplossing en pipet op en neer 7x met een P1000 pipet tip om cellen vermaal. Vermijd overmatige aanwrijven om cellysis te minimaliseren.
- Onderlaag de celsuspensie door langzaam pipetteren 200 pi 4% BSA oplossing in de bodem van de buis. Voorzichtig trekken de pipet tip om te voorkomen dat het verstoren van de celsuspensie laag. Na centrifugatie bij 280 xg gedurende 6 min, zuig de supernatant met P1000 en resuspendeer de cellen in 1 ml plaatmedium.
- Voeren celtelling met een hemocytometer. Verdun de celsuspensie tot 1000 cellen / ul, met plaatmedium.
- Met behulp van een vacuüm aspirator, zuig het laminine uit de beklede schalen in porties van ten hoogste drie gerechten. Plaat 120 pi (1,2 x 10 5 cellen / schaal (78,5 mm 2
- Na 1 uur wordt voorzichtig 3 ml kweekmedium niet geplaatste gebied van de kweekschaal om verstoring van de cellen te minimaliseren.
- Voer een half volledige mediumverversing op celcultuurschalen 3 d intervallen gedurende 3 weken.
2. Oogsten Gekweekte-dopaminerge neuronen voor RNA Sequencing
OPMERKING: Een overzicht van de cel oogsten en eencellige RNA-Sequencing protocol gegeven in figuur 1.
- Stappen om uit te voeren voordat de dag van het experiment
- Schoon borosilicaatglas capillaire buizen door sonicatie in 100% ethanol gedurende 15 minuten en daarna weer in gedestilleerd H2O gedurende 15 min. Giet de buis en bak 's nachts in een oven op 200 ° C tot RNase inactiveren.
- Gebruik vers geopendeRNase-vrij pipetpunten een voorraadoplossing van 10x reactiebuffer bereid door het mengen van 19 ul van 10x lysisbuffer van de sequencing kit met 1 pi van de RNase inhibitor oplossing (20 pi totaal volume) in een microcentrifugebuis. Spin down van het mengsel kort met behulp van een micro-centrifuge en blijf op ijs.
- Voeg 2 pi van de 10x reactiebuffer aan elk van de afzonderlijke 0,2 ml PCR buizen (gebruikt om de geoogste neuronen verzamelen). Label de buizen met geschikte tags van neuronen worden geoogst en ingevroren opslag bij 4 ° C.
- Stappen uit te voeren op de dag van het experiment
- Fabricage van de Harvesting pipetten.
- Trek micropipetten grote-tip diameter (2-8 pm) van de gebakken capillaire buis met behulp van een micro-elektrode trekker en de glas-gecoate verwarming gloeidraad van een microforge. Zet de trekker te micropipetten met een lange taper vormen. Gebruik een microforge uitgerust met een geijkte oculairgraticule en een high-power obsubjectieve naar de punt van de micropipet breken om de gewenste tip grootte (10 - 20 urn).
- Bevestig de micropipet in de microforge pipet houder en monteer de houder op de microforge. Breng de punt van de micropipet in beeld boven de met glas beklede gloeidraad met de mechanische manipulator van de microforge en schakel de stroom naar de gloeidraad te verwarmen. Raak de pipet tip om de gloeidraad. Schakel de stroom als de pipet tip is gesmolten aan de juiste diameter.
NOTITIE. Het afsluiten van de stroom zal ertoe leiden dat de gloeidraad plotseling naar beneden te bewegen en los te maken van de pipet tip, het produceren van een grote, open-tip pipet met de gewenste diameter. - Bewaar de ingevulde micropipetten in een gesloten doos totdat het nodig is.
- Het oogsten van de neuronen.
NOTITIE. Gekweekte neuronen werden geoogst na een gemodificeerde versie van een eerder gepubliceerd protocol 6.- grondig clean alle oppervlakken van de cel-oogsten kamer die in contact komen met de cultuur gerechten en verzameling buizen met behulp van vloeibare ontsmettingsmiddel en water, gevolgd door een spoeling met water komen. Veeg de gedesinfecteerde oppervlakken met 80% ethanol en vervolgens een-RNase-inhibitor toegediend af te vegen.
- Vul twee geïsoleerde containers met ijs, een met gewone (water) ijs en een andere met droogijs. Plaats de 0,2 ml PCR-collectie buizen die eerder gevuld met 2 pl van 10x reactiebuffer op de reguliere ijs.
- Verwijder de kweekschaal met de neuronen van de incubator, laat het kweekmedium van de schaal, spoelen met 2 ml RNase-vrij Dulbecco's PBS (DPBS) en vervangen door 1 ml van DPBS voor het oogsten.
- Identificeer fluorescerende, TH-positieve neuronen in de primaire middenhersenen culturen met behulp van een omgekeerde, epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een 40X fase doelstelling, een Hg lamp, en een GFP filter set.
- Plaats de pipet in de cel soma met behulp van een gemotoriseerde of handmatige micromanipulator. Zuig het neuron in de glazen micropipet met zachte zuigkracht oraal toegepast door de plastic buis aan de zijpoort van de micropipet houder. Verwijder onmiddellijk de micropipet met de cel van de baden oplossing.
- Plaats de pipetpunt in een 0,2 ml PCR buis verzameling met reactiebuffer en de punt breken tegen de zijkant van de buis dichtbij de bodem. Verdrijf de resterende vloeistof (0,5-1,5 pl) van de gebroken punt van de micropipet door een steriele 21 G naald in de achterkant van de micropipet en het toepassen van uitwendige druk.
- Centrifugeer de collectie buis gedurende 5 s met behulp van een desktop micro-centrifuge en invriezen in droogijs. Bewaar de verzamelbuizen waarin de afzonderlijke cellen bij -80 ° C. Gewoonlijk worden 5 de cellen geoogst per schaal gedurende een periode van 1 uur bij omgevingstemperatuur.
- Fabricage van de Harvesting pipetten.
3. Single-cell RNA-Seq Library Generation
- <li> Generatie van de eerste streng cDNA
- Breng de volgende reagentia op ijs de PCR kast. Bereid een eerste streng master mix plus 10% door het combineren van de volgende reagentia bij kamertemperatuur in een PCR kast: 2 pl 5x eerste streng buffer, 0,25 ul DTT (100 mM), 1 uL dNTP mix (10 mM), 1 ui oligonucleotide ( 12 pm), 0,25 pl RNase Inhibitor, en 1 pl reverse transcriptase (100 eenheden). Dit is de reverse transcriptase master mix (5,5 pi totaal volume per reactie).
- Neem de monsters uit de -80 C op droog ijs en breng aan de PCR kast. Voeg de volgende aan de enkele cel monster: 1 ui 3 'primer 1 en 1 pi gekwantificeerd RNA spikes. Breng monsters op een koelmachine blok een hot-deksel thermocycler vooraf bij 72 ° C.
- Incubeer de buizen in de thermocycler gedurende 3 min bij 72 ° C, en vervolgens de monsters aan een PCR koeler rack.Voeg 5,5 pi van de master mix (uit stap 3.1.1) aan elke reageerbuis en meng door pipetteren voorzichtig. Draai de 0,2 ul buizen voor 5 s en incubeer in een thermocycler als volgt: 42 ° C gedurende 90 min, 70 ° C gedurende 10 minuten. Houden op 4 ° C.
- Zuivering van Amplified First Strand cDNA.
OPMERKING: De PCR-geamplificeerde cDNA werd gezuiverd door immobilisatie op magnetische korrels. Gebruik een magnetische scheidingsinrichting voor 0,2 ml buizen.- Aliquot de magnetische korrels in 1,5 ml buizen. Voor elk gebruik, brengt kraal aliquots tot kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten en meng goed te dispergeren. Vortex magnetische korrels tot het gelijkmatig gemengd.
- Voeg 25 ul van magnetische korrels aan elk monster. Meng door pipetteren het volledige volume omhoog en omlaag op zijn minst 10x om grondig te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 8 minuten om de cDNA binden aan de kralen te laten.
- Bereiding van PCR Master Mix
- Bereid de ds-cDNA amplificatie PCR master mix voor alle reacties met een Additional 10% door 5 pl 10x PCR-buffer, 2 pl dNTP mix (10 mM), 2 pi PCR-primer 2 (12 uM), 2 pl 50x 2 polymerase mengsel en 39 pi nuclease vrij water (50 pi totaal volume / reactie).
- Amplificatie van First Strand
- Plaats de monsters en magnetische korrels op de magnetische scheidingsinrichting ≥5 min, tot de vloeistof volledig duidelijk en er zijn geen korrels meer in het supernatant.
- Het houden van de monsters op de scheiding apparaat, pipet het supernatant af en gooi. Spin de monsters gedurende 5 s aan de vloeistof te verzamelen van de zijkant van de buis. Plaats de monsters op de magnetische scheiding apparaat gedurende 30 s, verwijder alle resterende bovenstaande vloeistof met een pipet P10.
- Voeg 50 ul van het PCR master mix aan elke buis bevattende DNA gebonden aan de parels uit de vorige stap. Plaats de buis in een voorverwarmde thermal cycler (95 ° C) met een verwarmd deksel. Begin de thermische cycli met behulp van de volgende program: 95 ° C gedurende 1 minuut, 26 cycli van 95 ° C gedurende 15 s, 65 ° C gedurende 30 s, 68 ° C gedurende 6 min. Dan 72 ° C 10 min. Houden op 4 ° C.
OPMERKING: Raadpleeg sequencing handleiding voor meer informatie en om de sample-instellingen te optimaliseren.
- Zuivering van Amplified Dubbelstrengs cDNA
- Voeg 90 ul van kralen aan elk monster. Meng door pipetteren het volledige volume omhoog en omlaag op zijn minst 10x om grondig te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 8 minuten om de cDNA binden aan de kralen te laten. Plaats de monsters plus parels op de magnetische scheidingsinrichting voor ≥5 min, tot de vloeistof volledig duidelijk en er zijn geen korrels meer in het supernatant.
- Terwijl de monsters op de magnetische scheiding apparaat, de bovenstaande vloeistof en gooi. Houd de monsters op de magnetische scheidingsinrichting. Voeg 140 ul vers bereide 85% ethanol aan elk monster zonder de kralen. Wacht 30 s. Pipet uit de bovendrijvende. cDNA wordt gebonden aan de bea blijvends tijdens het wasproces.
- Herhaal de ethanol te wassen eens te meer.
- Kort draaien de monsters om de vloeistof te verzamelen van de zijkant van de buis. Plaats de monsters op de magnetische scheidingsinrichting voor 30 s, verwijder alle resterende ethanol met een pipet. Plaats de monsters bij kamertemperatuur gedurende 2-2,5 min totdat de pellet droog is en niet meer glanzend (dat wil zeggen voordat een scheur verschijnt).
LET OP: Droog de pellet slechts tot het net droog. De pellet ziet er mat zonder glans. Als de pellet niet droog is, zal ethanol in de steekproef putten blijven, geeft het versterkte cDNA recovery rate en de opbrengst zal verminderen. Als de pellet voorbij droog, zal er scheuren in de pellet. Het zal langer dan 2 minuten te rehydrateren te nemen en kunnen versterkte cDNA herstel en de opbrengst te verminderen. - Zodra de korrels droog, voeg 22,5 ul elutiebuffer aan de korrel pellet dekken. Verwijder de monsters van de magnetische scheidingsinrichting en meng om de kralen resuspenderen. Incubate bij KT gedurende 10 min hydrateren.
- Spin de monsters gedurende 5 s aan de vloeistof te verzamelen van de zijkant van de buis. Plaats de monsters weer op de magnetische scheidingsinrichting voor ≥1 min, tot de oplossing volledig helder.
OPMERKING: Een kleine populatie van kralen kunnen niet tegen de magneet pellet tijdens incubatie. Pipetteer deze unpelleted kralen op en neer te mengen met het supernatant en pipet die naar de magneet waar de rest van de korrels reeds gepelleteerd (zonder verstoring van de bestaande pellet). - Ga door met de incubatie tot er geen kralen in het supernatant blijven. Transfer heldere bovenstaande vloeistof die gezuiverde cDNA van elke buis naar een nuclease-vrij, lage wrijvingscoëfficiënt buis. Label elke buis met het monster informatie en bewaar bij -20 ° C. De monsters kunnen onbeperkt worden bewaard bij -20 ° C.
- Meting van DNA concentratie en fragmentgrootte
- Voer een kwaliteitscontrole door het kwantificeren van een 1 pl alIQUOT van het cDNA op een fluorometer. Cijfer 1 pl (3 ng) ds-cDNA met een elektroforesesysteem (zoals beschreven in 1).
- Fragmentatie van DNA
LET OP: Gebruik een DNA-monster voorbereiding kit.- Voeg 20 ul cDNA (35 ng totaal) met een buis. Voeg 25 ul van Tagment DNA (TD) buffer aan de buis met het cDNA.
- Voeg 5 ul van TDE1 (Tagment DNA Enzyme) aan de buis. Pipet op en neer 10x te mengen. Gebruik een nieuwe tip voor elk monster. Centrifugeer bij 280 xg bij 20 ° C gedurende 1 min.
- Plaats de monsters in een thermocycler met een verwarmd deksel en laat deze: 55 ° C, 5,5 min. Voeg snel 50 ul QG oplossing (gelextractiekit). Pipet op en neer 10x te mengen. Kunnen rechtstreeks naar de volgende stap.
- Zuivering van gefragmenteerde DNA
- Voeg 170 ul van kralen, pipet op en neer 10x te mengen. Laat het zitten voor 10 min. Zet buizen op de magneet. Laat de buizen zitten op de magneet gedurende 10 min.Terwijl de monsters op de magnetische scheidingsinrichting, pipet het supernatant en gooi.
- Laat de buis op de magneet en voeg 200 pl 85% ethanol. Laat zitten voor 30 s, verwijder dan ethanol. Herhaal de ethanol wassen. Spin de buis 1000 XG bij RT.
- Zet de buis weer op de magneet. Pipet off eventueel resterende ethanol. Laat de monsters gedroogd bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Voeg 21 ul elutiebuffer uit de gel extractie kit. Laat de buis zitten van de magneet, pipet op en neer 10x te mengen. Laat de buis zitten bij kamertemperatuur 15 min.
- Zet de buis naar de magneet voor 5 min. Pipetteer 20 ul oplossing (gezuiverde DNA) in een nieuwe buis.
- Tagging en PCR-amplificatie van het gefragmenteerde DNA
LET OP: In deze stap wordt het gezuiverde DNA wordt versterkt via een beperkte-cyclus PCR-programma. De PCR-stap voegt ook index 1 (i7) en index 2 (i5) alsmede gemeenschappelijke adapters (P5 en P7) (vereist voor cluster generatie en sequencing). Zie de DNA'svoldoende voorbereiding gids voor meer details.- In een nieuwe buis voeg 5 ul van index 2 primers (witte dop). Met behulp van een nieuwe pipetpunt voeg 5 ul van index 1 primer (oranje deksel). Voeg 15 ul PCR Master Mix aan elke buis.
- Voeg 5 ul PCR-primer cocktail aan elke buis. Voeg 20 ul van het gezuiverde DNA aan de buis. Voorzichtig pipet op en neer 3-5 keer.
- Voer PCR met het volgende programma op een thermocycler: 72 ° C gedurende 3 min, 98 ° C gedurende 30 s, 5 cycli van 98 ° C gedurende 10 s, 63 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 3 min. Houden op 10 ° C. Ga onmiddellijk de PCR clean-up of bewaar het monster bij 4 ° C gedurende maximaal 2 d.
- Zuivering van geamplificeerde DNA-fragmenten
- Breng de parels tot kamertemperatuur. Bereid verse 85% ethanol. Monsters te nemen uit de PCR-machine en spin down kort.
- Voeg 30 ul van kralen aan de buis. Voorzichtig pipet mengen op en neer 10x. Laat de buis op kamertemperatuur gedurende 5 minuten. plaats back op de magneet gedurende 5 min. Met de buis op de magneet gebruikt een pipet aan het supernatant verwijderen.
- Voeg 200 pl 85% ethanol aan elke buis. Pipette ethanol uit na 30 s. Herhaal dit 85% ethanol wassen. Pipette ethanol uit na 30 s.
- De buizen nog op de magneet en de doppen open en laat de korrels aan de lucht drogen gedurende 15 min. Verwijder de buizen uit de magneet.
- Voeg 32,5 ul elutiebuffer. Voorzichtig pipet op en neer 10x. Incubeer van de magneet voor 10 - 15 min.
- Zet de pijpen naar de magneet gedurende 2 minuten of totdat de bovenstaande vloeistof is verdwenen. Zorgvuldig overdracht 30 pi van het supernatant naar een nieuwe buis.
- Meting van DNA concentratie en fragmentgrootte
- Voer een kwaliteitscontrole door het kwantificeren van de DNA concentratie van 1 pi van de cDNA op een fluorometer. Bepaal de fragmentgrootte van het DNA door elektroforese. Beoordelen van 1 pl (3 ng) van ds-cDNA.
- sequencing
- Breng de enkele cel RNA-Seq bibliotheken om een sequencing faciliteit. Genereer 100 bp sequencing leest op een sequencer naar aanleiding van een eerder gepubliceerd protocol 4.
OPMERKING: Elke sequencing bibliotheek genereert> 20 miljoen unieke mapping leest.
- Breng de enkele cel RNA-Seq bibliotheken om een sequencing faciliteit. Genereer 100 bp sequencing leest op een sequencer naar aanleiding van een eerder gepubliceerd protocol 4.
OPMERKING: Voor de volgende stappen te gebruiken reagentia van het commerciële sequencing kit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier beschrijven we een protocol voor het kweken van ventrale middenhersenen neuronen van de muis tot expressie eGFP gedreven door een tyrosine hydroxylase promotor sequentie, oogsten individuele fluorescente neuronen van de kweken en het meten van hun RNA transcriptoom middels RNA-seq (figuur 1). De gegevens toonden aan dat 100% van de TH-eGFP-positieve cellen die werden geoogst en gesequenced waren dopaminerge neuronen, gebaseerd op de aanwezigheid van de volgende drie DA-gerelateerde gen transcripten, TH, dopadecarboxylase (DDC) en de dopamine transporter DAT (slc6a3). Alle TH-eGFP positieve cellen brachten deze drie genen zoals beoordeeld door RNA-Seq. Iedere individuele cel RNA-Seq bibliotheek 6000 - 8000 werden eiwitcoderende genen gedetecteerd (figuur 2). De dopaminerge neuronen robuuste expressie dopamine-verwante transcripten naast verscheidene nicotine acetylcholine receptor (nAChR) subeenheden (tabel 1). We vonden dat geent al van de cellen die voor TH waren GABAergic negatief waren; Daarom definieerden we cellen als GABAerge gebaseerd op de aanwezigheid van het transcript GAD1 gemeten met RNA-seq. De cellen die we gedefinieerd als GABAergic neuronen niet-dopamine-gerelateerde transcripten niet uitdrukken, maar zoals gezegd do een belangrijke gen voor GABA synthese, GAD1 uit te drukken. De eencellige bibliotheken onthulde ook lange niet-coderende RNA, evenals transcripties die kanalen, receptoren, kerneiwitten, histonen, organellen eiwitten en transcriptiefactoren.
Figuur 1. RNA-Seq in individuele neuronen, zoals uitgevoerd in onze experimenten op Primaire TH-eGFP Mouse Middenhersenen Cultures. (1) cultuur TH-eGFP muis ventrale neuronen gedurende 3 weken. (2) Bepaal fluorescerende enkele neuronen door spannende GFP met behulp van een Hg lichtbron en FITC / GFP filter. (3) With dezelfde 40X doelstelling van fase optica, visualiseren enkele neuronen en de juiste positie van de pipet. (4-5) Zuig het enkele cel in het glas micropipet. Beelden tonen een cel na de oogst: (4) Fase 40X; (5) eGFP fluorescentie. (6) Lyse cellen met lysisbuffer met oligo-dT primer bij 72 ° C. (7) cDNA-synthese; 26 cycli amplificatie. (8)-transposon gemedieerde "tagmentation" cDNA. (9) cDNA kwaliteitscontrole en multiplex sequencing. (10) Na geautomatiseerde analyse met behulp van Tophat, manchetknopen en Cuffdiff 7. Relatieve rijkdom van uitgedrukte genen werd gemeten in eenheden van fragmenten per kilobase van transcript per miljoen toegewezen leest (FPKM). Het doel van RNA-seq is een lijst van genen tot expressie gebracht in een cel en hun relatieve abundantie verschaffen. Afbeeldingen (2-4) zijn van de huidige WORk, (6-10) is gemodificeerd vanuit een eerder verslag 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Het aantal van eiwit-coderende genen ontdekt in de Single dopaminerge RNA-Seq bibliotheken Generated van TH-eGFP-positieve cellen. 6000 - 8000 eiwit genen werden gedetecteerd in de enkele cel bibliotheken. FPKM: Fragmenten per kilobase van transcript per miljoen toegewezen leest (FPKM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| genen | DA enkele cellen n = 10 | GABAerge enkele cellen n = 7 |
| FPKM (gemiddelde ± SEM) | ||
| TH | 4714 ± 764 | 1,2 ± 0,14 |
| DDC | 779 ± 167 | 0,8 ± 0,1 |
| slc6a3 / DAT | 506 ± 144 | 0,5 ± 0,04 |
| DRD2 | 14 ± 8 | 0,1 ± 0,004 |
| chrna6 (α6) | 174 ± 57 | 0.0 |
| chrna4 (α4) | 17 ± 5 | 26,4 ± 2,3 |
| chrnb2 (β2) | 9 ± 3 | 17,3 ± 1,2 |
| chrnb3 (β3) | 38 ± 13 | 0.0 |
| GAD1 | 0.0 | 959,0 ± 70,0 |
| Htr3a | 0.0 | 0,6 ± 0,01 |
| Htr3b | 0.0 | 0.0 |
Tabel 1. Dopamine-gerelateerde en nAChR Gene Afschriften in dopaminerge en GABA-erge neuronen op dag 21 in VentrMidbrain Cultures. RNA-Seq gegevens voor TH-eGFP positieve en negatieve neuronen worden weergegeven. Enkele cellen werden geoogst op kweek dag 21. RNA-Seq gegevens blijkt dat TH-eGFP positieve neuronen had hoge niveaus van DA-gerelateerde gen transcripten, waaronder tyrosine hydroxylase (TH), dopadecarboxylase (DDC), de dopamine transporter DAT (slc6a3) en nicotine acetylcholine receptor (nAChR) subeenheden waaronder α6, α4, β2 en β3. Echter, deze cellen had lage niveaus van het GABAerge merkergen glutaminezuur decarboxylase 1 (GAD1) en de serotonine 5-HT3 receptor A en B-subeenheden (Htr3A en Htr3B). GABA-erge neuronen hebben een lage tot geen niveausvan DA-gerelateerde gen-transcripten, chrna6, chrnb3 en Htr3A / B, maar hebben een hoog niveau van GAD1. RNA-Seq (Cuffdiff) gegevens worden getoond voor dopamine-gerelateerde, GABAergic, nicotinezuur receptor en serotonine transcripties. FPKM: Fragmenten per kilobase van transcript per miljoen toegewezen leest (FPKM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier isoleren we enkele cellen uit een heterogene populatie met behulp van een fluorescent label, dan studeren elke cel met single-cell RNA-seq. Wij rapporteren dat 100% van de levende TH-eGFP cellen die we geoogst en de sequentie inderdaad dopaminerge neuronen, gebaseerd op de aanwezigheid van de volgende drie DA-gerelateerde gen transcripten, TH, DDC en slc6a3. Alle TH-eGFP positieve cellen brachten deze drie genen zoals beoordeeld door RNA-Seq. Dit was overeenstemmend met elektrofysiologische studies waaruit bleek dat elk TH-eGFP cel ook weergegeven een repertoire van ionkanalen geassocieerd met dopaminerge neuronen 8, 9. In dit protocol hebben we gebruik gemaakt van de GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP muizenstam 10 als een betrouwbare marker voor levende dopaminerge neuronen. In WT culturen er momenteel geen betrouwbare manier om levende dopaminerge neuronen basis van hun morfologie identificeren. Ondanks onze uitgebreide ervaring in identiteittifying en opnemen van dopaminerge neuronen, in het wild-type culturen slechts drie op de tien van de vermoedelijke dopaminerge cellen geoogst waren dopaminerge neuronen. Daarnaast hebben we vastgesteld dat niet alle cellen die TH negatief waren waren GABAerge. We gedefinieerd cellen als GABAerge basis van de aanwezigheid van de GAD1 transcript en de afwezigheid van de DA-verwante transcripten zoals beoordeeld door RNA-seq.
Omdat dopaminerge neuronen vormen een kleine minderheid van de neuronen uitgedrukt in primaire kweken VM, zal het vermogen deze neuronen betrouwbaar te identificeren in levende culturen de reeks beschikbare eencellige studies versterken. Dit protocol kan worden gebruikt voor neuroprotectie, neurodegeneratie en farmacologische assays om het effect van diverse behandelingen op de dopaminerge transcriptoom bestuderen. Bovendien kan men dit protocol te gebruiken voor immunohistochemische, elektrofysiologische, biofotonische 11, en in principe, proteomics testen. Dese assays zijn bijzonder nuttig voor de ziekte en verslaving onderzoek Parkinson. Maar natuurlijk analoge protocollen op GENSAT muizen of soortgelijke gemerkt muizen, kan worden gebruikt voor andere ziektetoestanden of op cellen die zeldzaam zijn. Bovendien, dit protocol geeft een opkomende het oog op de heterogeniteit binnen een bepaalde neuronale subtype.
In eerdere studies, na het oogsten van de enkele cel plaatsten we het direct in PBS; Maar nu plaatsen we de geoogste enkele cel direct in de reactie buffer. Dit leidt tot beter RNA-Seq bibliotheken zoals bepaald door het aantal genen gedetecteerd in elke bibliotheek. Een van de belangrijkste beperkingen van deze techniek is dat fluorescent gelabeld cellen vereist. Zoals eerder gezegd, is er geen echt betrouwbare manier om een specifiek celtype is uit een gemengde cultuur van morfologie. Het grote aanbod van cel-specifieke fluorescerende of Cre-expressie muis lijnen Now biedt passende wijze worden voorzien cellen in veel gevallen. Echter, zorg should worden genomen bij het selecteren van een geschikte fluorescerende muis lijn, als een uitgebreide studie van transgene muizen lijnen bleek dat TH-Cre knock-in muis lijnen vertonen uitgesproken transgenexpressie in nondopaminergic cellen 12.
Bovendien, een stap die moet worden geoptimaliseerd in toekomstige experimenten is het gewenste formaat tip van de micropipet. Als toekomstige experimenten omvatten het gebruik van andere dan dopaminerge neuronen celtypes nodig de micropipet formaat tip worden geoptimaliseerd voor de cel van belang.
RNA deep sequencing is een meer krachtige techniek dan microarrays. RNA-Seq geeft goede run-to-run reproduceerbaarheid. Het dynamisch bereik gedetecteerd is vergelijkbaar met de werkelijke transcript overvloed in cellen. Men kan alternatieve splice vormen en nieuwe isovormen te detecteren. De novo analyse van monsters zonder referentie-gen mogelijk is; en als een nieuwe referentie-gen ontdekt de gegevens opnieuw worden geanalyseerd op despecifiek gen (s) zonder de nat-werk experiment opnieuw 13 draaien.
Samenvattend vermelden wij dat 100% van de levende TH-eGFP cellen die werden geoogst en gesequenced waren dopaminerge neuronen. Deze techniek uitstrekt andere rapporten die acuut gedissocieerde identificeren of lange-termijn gekweekte dopaminerge neuronen van GENSAT muizen, 14, 15 en de techniek wijdverspreide toepassingen in neurologie en moleculaire biologie hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1x | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x stock solution, 1x final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20 °C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips P1000 | Sorenson Bioscience | Inc. 10130 | |
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37 °C Water bath | |||
| 37 °C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps - 2x3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps - Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate-buffered solution (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
| 21 G needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100 rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50x 2 polymerase mix | 50x Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10x PCR buffer | 10x Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110 rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
References
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
- Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
- Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H.
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
- Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
- Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).
