-Alta resolución respirometría para evaluar la función mitocondrial en células intactas y permeabilizadas

Summary

De alta resolución de respirometría se utiliza para determinar el consumo de oxígeno mitocondrial. Se trata de una técnica sencilla para determinar los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial '(I-IV) la frecuencia respiratoria, la capacidad del sistema de transporte de electrones mitocondrial máxima, y ​​la integridad de la membrana mitocondrial externa.

Abstract

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

Introduction

Las mitocondrias desempeñan funciones importantes en el metabolismo de la energía celular, especialmente mediante el uso de oxígeno para producir el trifosfato de adenosina (ATP). Ellos están implicados en la muerte celular y en varias enfermedades humanas. fosforilación oxidativa mitocondrial (fosforilación oxidativa) combina el transporte de electrones a lo largo de la cadena de transporte de electrones con el consumo de oxígeno y la síntesis de ATP. El ciclo de los ácidos tricarboxílicos mitocondrial (TCA) está implicada en la conversión de proteínas, carbohidratos y grasas en compuestos ricos en energía como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y dinucleótido de flavina adenina (FADH _2). Los electrones del NADH y FADH ₂ se transfirieron a continuación a los complejos de proteínas de la cadena de transporte de electrones respiratorios (I a IV) localizado en la membrana mitocondrial interna. Además, otros dos vías redox pueden transferir electrones a la cadena de transporte de electrones: i) mitocondrial de electrones de transferencia de flavoproteínas (ETF) que se encuentra en la cara de la matriz interior mitomembrana mitocon-, y materiales de electrones de β-oxidación de ácidos grasos; y ii) mitocondrial glicerofosfato deshidrogenasa que oxida glicerofosfato a dihidroxiacetona fosfato y se alimenta electrones a la cadena de transporte de electrones mitocondrial. Complejo IV (el último aceptor de electrones) transfiere los electrones a una molécula de oxígeno, la conversión de oxígeno a dos moléculas de agua. En movimiento de los electrones de complejo de la cadena de transporte de electrones respiratoria I a IV está acoplado con el flujo de protones a partir de la matriz mitocondrial al espacio intermembrana que establece un gradiente electroquímico a través de la membrana interna mitocondrial. Después, mitocondrial complejo V (ATP sintasa) lanzaderas los iones de hidrógeno de nuevo en la matriz mitocondrial y sintetiza moléculas de ATP. Función de la fosforilación oxidativa se puede evaluar in vivo e in vitro usando diversas técnicas y diversos estados respiración mitocondrial se pueden obtener. En las mitocondrias aisladas de la siguiente respiratoestados ry se pueden medir: i) basal respiración mitocondrial (estado 1), ii) el consumo de oxígeno después de la adición de los sustratos específicos de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial (estado 2), iii) el consumo de oxígeno mitocondrial máxima después de la adición de concentraciones saturantes de difosfato de adenosina (ADP) (estado 3) y, iv) la respiración en reposo después del consumo de ADP (convertida en ATP) (estado 4). En células intactas los siguientes estados respiratorios se pueden medir: i) basal consumo de oxígeno celular en presencia de sustratos endógenos y ADP, ii) el consumo de oxígeno celular basal en presencia de oligomicina (oligomicina insensible a la respiración) y sensible a la oligomicina respiración (ATP volumen de negocios), iii) FCCP respiración desacoplada, y iv) la respiración no mitocondrial después de la adición de antimicina A y la rotenona. En las células permeabilizadas, sustratos específicos de los complejos de la cadena de transporte de electrones y ADP se pueden añadir y complejos dependientes de máximas velocidades de respiración sUCH I- tan complejo, II- y respiratoria IV-dependientes se puede medir.

Las mediciones de la respiración celular proporcionan información importante sobre la capacidad respiratoria mitocondrial específica de los complejos I-IV, la integridad mitocondrial y el metabolismo de ^{1, 2, 3} energéticos. Uno de los dispositivos que permiten mediciones de consumo de oxígeno mitocondrial con gran precisión, resolución y sensibilidad es la alta resolución oxygraph ^4. El dispositivo de alta resolución oxygraph contiene dos cámaras con puertos de inyección y cada cámara está equipada con un sensor de oxígeno polarográfico. suspensiones mitocondriales celulares o aisladas se agitan continuamente en el respirómetro. Para evaluar la función mitocondrial, sustratos e inhibidores de la actividad del complejo mitocondrial puede añadirse siguiendo protocolos estándar. Sustratos e inhibidores se pueden valorar por inyección into las cámaras del oxygraph, y las tasas de consumo de oxígeno se calculó utilizando el software y se expresó como picomoles por segundo por número de células. De alta resolución de respirometría ofrece varias ventajas sobre los dispositivos tradicionales y convencionales electrodo de oxígeno polarográfico incluyendo aumento de la sensibilidad y la capacidad de trabajar con un número pequeño de muestras biológicas tales como células intactas o permeabilizadas. Además, cada dispositivo contiene dos cámaras, y las tasas respiratorias se pueden grabar simultáneamente para la comparación de las concentraciones de oxígeno. La alta resolución de oxygraph también tiene la ventaja de la reducción de la fuga de oxígeno a partir de las cámaras del dispositivo en comparación con los dispositivos tradicionales de electrodos de oxígeno polarográficos. Otro dispositivo desarrollado recientemente para medir el consumo de oxígeno celular es el 96 pocillos analizador de flujo extracelular ^5. El analizador de flujo extracelular está equipado con fluorescencia en lugar de sensores polarográficas. Las ventajas de la extracelularanalizador de flujo en comparación con la de alta resolución oxygraph son i) que es un dispositivo en gran medida automatizado, ii) es posible medir el consumo de oxígeno en 24 y placas de 96 pocillos para cribado de alto rendimiento, por lo tanto requieren menores cantidades de muestras biológicas, y iii) es posible método de medición del flujo glucolítico celular. Las desventajas del analizador de flujo extracelular en comparación con el de alta resolución oxygraph son i) los altos costos del dispositivo y de los consumibles, tales como placas fluorescentes, que son de un solo uso, y ii) sólo cuatro compuestos por ensayo / pocillo son inyectables , por lo tanto, el sistema no es factible para protocolos de titulación sustrato-desacoplador-inhibidor.

En el presente estudio, utilizamos respirometría de alta resolución para determinar la respiración mitocondrial. Para los experimentos de consumo de oxígeno celulares, las células se permeabilizaron para permitir la entrada de ADP exógeno y sustratos oxidables mitocondriales para la alimentación de electrones en Complexes del sistema respiratorio. Este enfoque permite la disección de los complejos mitocondriales individuales capacidades respiratorias, que es una clara ventaja en comparación con las células intactas (muchos sustratos son células impermeant). Sin embargo, célula permeabilización de la membrana perturbará la barrera entre el citosol y en el espacio extracelular y medio (lavado de solutos citosólicas) y la composición del espacio intracelular está equilibrada con el medio extracelular. Uno de los inconvenientes de las células permeabilizadas más células intactas es que la membrana externa mitocondrial puede ser dañado si se emplean cantidades excesivas de detergente durante la permeabilización celular. En células intactas, basal, acoplar y desacoplar la respiración de las células intactas se puede medir. Este método evalúa el consumo de oxígeno de las células intactas sin la adición de sustratos exógenos y ADP, la reproducción de la función respiratoria en la célula integrada y que también proporciona información sobre transpo electrones mitocondrial maximalcapacidad rt ^{6, 7.} Una de las ventajas de las células intactas más de células permeabilizadas es que entorno celular no se interrumpe y las mitocondrias están en contacto con el conjunto de componentes de las células. Con el fin de permeabilizar la membrana plasmática celular, detergentes tales como digitonina se han usado ^8. Sin embargo, la integridad de la membrana externa mitocondrial puede verse comprometida si se emplean cantidades excesivas de digitonina. Para confirmar que la integridad de la membrana externa mitocondrial no se vea comprometida en las células permeabilizadas, la titulación de digitonina se realiza para determinar la concentración óptima para la permeabilización celular. Para estos experimentos, las células se resuspendieron en medio de la respiración y la concentración de digitonina se titula mediante respirometría en presencia de sustratos y ADP mitocondriales, y las tasas de respiración se miden. La respiración de células intactas, no permeabilizadas no se estimula en presencia de mitochondrial sustratos y ADP. Sin embargo, la posterior titulación digitonina por pasos produciría permeabilización gradual de las membranas de plasma, y ​​se obtiene una óptima concentración de digitonina. Esto se demuestra por el aumento de la respiración hasta alcanzar la plena permeabilización. Calidad mitocondrial y la integridad de la membrana externa se pueden verificar mediante la adición exógena citocromo c ^{2, 9.} El citocromo c es una proteína que lleva 12 kDa de electrones de la cadena mitocondrial de transporte de electrones ^{10, 11, 12.} Se localiza en el espacio intermembrana mitocondrial, y está implicado en el consumo de oxígeno, que lleva electrones de complejo III a IV complejo. Una vez que la membrana externa mitocondrial está dañado, el citocromo c se libera, y el consumo de oxígeno mitocondrial se reduce. Tras la adición de citocromo c exógeno, cualquier aumento en la respiración mitocondrial es indicativo de unainterrumpida membrana externa mitocondrial.

En las células permeabilizadas, sustratos e inhibidores de la actividad del complejo mitocondrial se añaden después de varios protocolos ^{3, 9.} Por ejemplo con el fin de investigar la frecuencia respiratoria complejos impulsada mitocondriales, el siguiente protocolo se puede utilizar. Después de la permeabilización de las células, primero complejo I se estimula por el malato de sustratos y glutamato, que generan NADH como sustrato para la cadena respiratoria y provocar la activación del complejo I. Después, se añade ADP para la conversión a ATP (estado 3, activa complejo I-dependiente de la respiración). Después de que se alcanza un valor estable, rotenona (complejo I mitocondrial inhibidor) se administra para inhibir el complejo I. La rotenona es seguido por succinato de FADH ₂ y para activar el complejo II (II dependiente de la respiración complejo el estado 3, activa). Con el fin de medir la respiración IV dependiente de complejo, primero complejo IIIrespiración dependiente es inhibida por la adición de antimicina A (mitocondrial inhibidor del complejo III). Después, complejo respiración IV-dependiente se estimula mediante la administración de ascorbato y tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD puede auto-oxidar en el tampón de la respiración, por lo tanto la máxima complejo IV dependiente de la tasa de respiración (estado 3) se calcula restando las tasas de respiración antes y después de la adición de azida de sodio, un inhibidor del complejo IV mitocondrial. Los experimentos de respiración pueden llevarse a cabo en dos cámaras de un oxygraph en paralelo-uno que sirve como control (células no estimuladas), los otros que contienen las células estimuladas. Obviamente, las células pueden ser pre-tratadas de varias maneras, por ejemplo, con fármacos que afectan las funciones mitocondriales, antes de su consumo de oxígeno se mide en la cámara de oxygraph. Este protocolo permite el examen funcional de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial individuales. Además, se puede medir ADP estimulada máximarespiración (estado 3) de las células permeabilizadas, utilizando ácido graso exógeno en forma de palmitato. En este protocolo, las acciones concentradas de palmitato de sodio se conjugan con albúmina de ácidos grasos de ultra bovino libre de suero (BSA) (relación 6: 1 molar palmitato: BSA). Posteriormente, las células primero se permeabilizadas con digitonina y la respiración mitocondrial se evalúa mediante la adición de carnitina y palmitato seguido de la adición de ADP (estado 3, la respiración máxima). A continuación, se añade oligomicina para imitar el estado 4 (4o estado) y la relación del control respiratorio (valor RCR) se calcula como el estado 3 / estado 4o. β-oxidación promueve la producción de acetil CoA (que entra en el ciclo TCA) y la generación de FADH ₂ y NADH, los electrones de los cuales se pasan a la cadena de transporte de electrones por flavoproteína de electrones transferencia y β-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa. Las mitocondrias son en el centro del metabolismo de ácidos grasos y se describen protocolo palmitato-BSA puede ser utilizado por los investigadores que examinaron grasaty la oxidación de ácidos. En células intactas, se añaden activadores e inhibidores de la actividad del complejo mitocondrial siguiendo un protocolo diferente ^{6, 9.} Para estos experimentos, primero el consumo de oxígeno de las células no permeabilizadas en ausencia de sustratos exógenos se mide (fosforilación de la tasa de respiración). Entonces, la tasa de respiración no de fosforilación se mide después de la adición de oligomicina, que es un inhibidor de la ATP sintasa mitocondrial. Posteriormente, el protonóforo carbonil cianuro de p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) se administra a varias concentraciones y se mide la frecuencia respiratoria mitocondrial desacoplado máxima. Protonóforos como FCCP pueden inducir un aumento de la permeabilidad de protones de la membrana interna, lo que permite el movimiento pasivo de protones para disipar el gradiente de quimiosmótica. Un aumento en la permeabilidad de protones desacopla la respiración oxidativa (sin producción de ATP) y induce un aumento en oxygen consumo. Después, se añaden rotenona y antimicina A para inhibir la respiración mitocondrial y la respiración mitocondrial no se resta de todas las otras frecuencias respiratorias.

Las tasas de consumo de oxígeno se pueden expresar como IO ₂ [pmol x seg ^-1 x 10 ^-6 células] (flujo de oxígeno por millón de células) que se calcula dividiendo el flujo de oxígeno-volumen específico (en la cámara de oxígeno cerrado), JV, O ₂ [pmol x seg ^-1 x ml ^-1] por la concentración de células en la cámara celular (número de células por volumen [10 ⁶ células ∙ ml ^{1]) 15.} Masa de células de flujo de oxígeno específico, JO ₂ [pmol x seg ^-1 x mg ^-1], es el flujo por célula, IO ₂ [pmol x ^seg-1 x 10 ^-6 células], dividido por la masa por célula [10 mg ∙ ⁶ células]; o volumen específico de flujo, JV, _O2 [pmol x seg ^-1 x ml ^-1], dividido por la masa por volumenUME [mg ∙ ml ^1]. JO ₂ es el flujo de oxígeno por la proteína celular, peso seco o volumen celular.

En el presente estudio el uso de alta resolución respirometría, describimos los protocolos para determinar i) la concentración de digitonina óptima para completa permeabilización de la membrana plasmática celular (ensayo de valoración de digitonina), ii) integridad de la membrana externa mitocondrial usando exógena citocromo c, iii) los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial I , las tasas respiratorias máximas II y IV en las células HepG2 digitonina permeabilized en presencia de ADP exógeno y sustratos de la cadena respiratoria mitocondrial, y iv) basal, junto y máximo respiración desacoplada (máxima capacidad de transporte de electrones) de las células intactas sin la adición de sustratos exógenos y ADP, la reproducción de la función respiratoria en la célula integrada.

Protocol

1. Cultura de la célula Células de cultivo humano hepatoma HepG2 6 en 25 cm 2 frascos de cultivo de células en medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) que contiene 10% de suero inactivado por calor bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C en una incubadora (5% CO 2, 95% de aire) (densidad de siembra: 1 x 10 6 células por 25 cm 2 frasco de cultivo celular, tiempo de incubación en la incubadora a 37 ° C: 48 h, l…

Representative Results

Determinación de la concentración óptima de digitonina para la permeabilización celular: Titulación Experimento digitonina Digitonina valoración se realiza para determinar la concentración óptima para la permeabilización de las células HepG2. Para estos experimentos, digitonina se valora en células intactas en presencia de rotenona, succinato (mitocondrial complejo sustrato II) y una cantidad saturante de ADP (para ind…

Discussion

El objetivo del presente protocolo fue utilizar respirometría de alta resolución para medir los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial '(I-IV) la frecuencia respiratoria, la capacidad del sistema de transporte de electrones mitocondrial máxima y la integridad de la membrana mitocondrial externa.

Hay algunos pasos críticos dentro del presente protocolo. En primer lugar, las tasas de consumo de oxígeno celular por lo general se normalizaron al número de células (pmol / [se…

Materials

ADP	Sigma	A 4386	Chemical
Antimycin A	Sigma	A 8674	Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate	Merck	1.00127	Chemical
BSA	Sigma	A 6003	Chemical
FCCP	Sigma	C 2920	Chemical, dissolve in ethanol
Countess automated cell counter	Thermo Fisher Scientific	n/a	Automated cell counting instrument
Cytochrome c	Sigma	C 7752	Chemical
Digitonin	Sigma	D 5628	Chemical, dissolve in DMSO
DMEM	Gibco	31966021	Medium
EGTA	fluka	3779	Chemical
FBS	Gibco	26010-074	Medium component
Glutamate	Sigma,	G 1626	Chemical
Hepes	Sigma	H 7523	Chemical
KCl	Merck	1.04936	Chemical
KH2PO4	Merck	1.04873	Chemical
K-lactobionate	Sigma	L 2398	Chemical
MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	High-resolution respirometry instrument
Oligomycin	Sigma	O 4876	Chemical, dissolve in ethanol
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122	Chemical
Sodium azide	Sigma	S2002	Chemical
Rotenone	Sigma	R 8875	Chemical, dissolve in ethanol
Succinate	Sigma	S 2378	Chemical
Taurine	Sigma	T 8691	Chemical
TMPD	Sigma	T 3134	Chemical
Trypsin	Sigma	T 4674	Chemical