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Biologia

Drosophila preparazione e imaging longitudinale della funzione cardiaca in vivo utilizzando Optical Coherence Microscopy (OCM)

Published: December 12, 2016
doi:
10.3791/55002
, , , , , , , ,
1Bioengineering Program,Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering,Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology,Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Abstract

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Introduction

Studio longitudinale del cuore nei piccoli animali contribuisce alla comprensione di una varietà di malattie cardiovascolari correlate umane, come ad esempio difetti cardiaci congeniti legati gene 1,2. Nei decenni passati, vari modelli animali, come ad esempio 3,4 mouse, Xenopus 5,6, 7,8 zebrafish, aviario 9, e Drosophila 10-16, sono stati utilizzati per condurre il cuore umano-sviluppo relativi ricerca. Il modello di topo è stato ampiamente utilizzato per studiare lo sviluppo cardiaco normale e anormale e fenotipi difetto cardiaco a causa della sua somiglianza con lo 3,4 cuore umano. L'embrione Xenopus è particolarmente utile nello studio di sviluppo del cuore per la sua maneggevolezza e trasparenza parziale 5,6. La trasparenza dell'embrione e larva precoce del modello zebrafish permette una facile l'osservazione ottica di 7,8 sviluppo cardiaco. Il modello di aviaria è un tema comune di studi di cuore di sviluppo because il cuore può essere facilmente accessibile dopo aver rimosso i gusci d'uovo e la somiglianza morfologica dei cuori aviaria per l'uomo 9. Il modello Drosophila ha alcune caratteristiche uniche che lo rendono ideale per l'esecuzione di studi longitudinali del cuore. In primo luogo, il tubo cuore di Drosophila è ~ 200 micron sotto la superficie dorsale, che fornisce la convenienza per l'accesso ottico e l'osservazione del cuore. Inoltre, molti meccanismi molecolari e percorsi genetici sono conservati tra Drosophila e vertebrati. I ortologhi di oltre il 75% dei geni delle malattie umane sono stati trovati in Drosophila, che hanno reso ampiamente usato negli studi di transgenici 11,13. Inoltre, si ha un breve ciclo di vita e bassi costi di manutenzione, ed è stato comunemente utilizzato come modello esemplare per la ricerca biologia dello sviluppo 14-16.

Studi precedenti hanno descritto i protocolli per il controllo delle funzioni cardiache Drosophila come l'haArtbeat. Tuttavia, le procedure di dissezione sono stati richiesti 17,18. L'imaging ottico fornisce un modo efficace per visualizzare sviluppo cardiaco negli animali a causa della sua natura non invasiva. Diverse modalità di imaging ottico sono stati applicati nello svolgimento di studio cardiaco animale, come microscopia a due fotoni 19, microscopia confocale 20,21, foglio di microscopia ottica 22, e tomografia a coerenza ottica (OCT) 16,23-26. Comparativamente, OCT è in grado di fornire grande profondità di imaging in piccoli cuori animali senza utilizzare mezzi di contrasto, mantenendo un'alta risoluzione e una velocità di imaging altissima, che sono importanti per gli animali vivi di imaging. Inoltre, il basso costo di sviluppare un sistema PTOM gode popolare questa tecnica per imaging ottico di campioni. Ottobre è stato utilizzato con successo per lo studio longitudinale della Drosophila. Utilizzando Office, l'imaging cardiaco morfologica e funzionale, è stata eseguita per studiare le strutture del cuore, il funcruoli zionali di geni e dei meccanismi di difetti cardiovascolari nei modelli mutanti durante lo sviluppo cardiaco. Ad esempio, il declino della funzione cardiaca età-dipendente è stata confermata con l'enzima legati (ACER) gene down-regolato dell'enzima di conversione in Drosophila con 27 ott. Fenotipizzazione di cardiomiopatia correlata gene è stata dimostrata in Drosophila utilizzando ottobre 28-33. La ricerca che utilizza ottobre ha anche rivelato il ruolo funzionale del gene SOX5 umana nel cuore di Drosophila 34. Rispetto Office, OCM utilizza un obiettivo con un'apertura numerica più elevata prestazione migliore risoluzione trasversale. In passato, la disfunzione cardiaca causata da un silenziamento ortologo gene circadiano umano dCry / dClock è stato studiato utilizzando un sistema OCM personalizzata 15,16, così come l'effetto di alto contenuto di grassi-dieta su cardiomiopatie in Drosophila comprendere indotta obesità umana malattie cardiache. 15

Qui, thprotocollo sperimentale e viene riassunta per lo studio longitudinale dei cambiamenti morfologici e funzionali cardiaci in Drosophila in seconda instar (L2), terzo stadio (L3), giorno pupa 1 (PD1), giorno pupa 2 (PD2), pupa giorno 3 (PD3) , pupa giorno 4 (PD4), pupa giorno 5 (PD5) e adulti (Figura 1) utilizzando OCM per facilitare lo studio delle patologie cardiache congenite umane legate. parametri funzionali cardiaci, come risorse umane e CAP sono stati quantitativamente analizzati a diversi stadi di sviluppo per rivelare le caratteristiche di sviluppo cardiaci.

Protocol

1. Preparazione di OCM sistema per l'imaging ottico di Drosophila 16 Selezionare uno spettrometro e una fotocamera scansione linea ad alta velocità che offre un frame rate di almeno 80 frame / sec in modo che il sistema di OCM sarà in grado di risolvere il battito cardiaco di Drosophila. Utilizzare una sorgente di luce a banda larga per garantire la risoluzione assiale di 2 micron a identificare la struttura cuore di Drosophila. Utilizzare un obi…

Representative Results

L'imaging cardiaco longitudinale è stato condotto utilizzando i moscerini della frutta con il 24B-GAL4 / + ceppo a temperatura ambiente con OCM. Le misurazioni sono state effettuate a L2, L3, e ad 8 intervalli hr da PD1 a PD4, e il giorno adulto 1 (AD1) per seguire il processo metamorfosi (Tabella 1). Larva, pupa presto, tardi pupa e adulto mosche sono stati montati sui vetrini come mostrato nella figura 1A. Le caratteristiche del segmento del cuore per le mosche larvali e adulte s…

Discussion

La tachicardia di Drosophila, con un HR massima intorno a 400 bpm nelle fasi larvali e adulte, richiede alta velocità di imaging per risolvere i diastole e sistole del cuore (non meno di 80 fotogrammi / sec sulla base di esperienze). Grazie allo spessore piccole dimensioni camera cardiaca e micron scala parete cardiaca (5 – 10 micron), una risoluzione spaziale elevata (migliore di 2 micron) è richiesto per risolvere le strutture tubo cuore. In questo studio, ad alta risoluzione e sistema OCM velocità altissi…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.

Materials

Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
Image J National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500
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Riferimenti

  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021 (2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213 (2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236 (2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425 (2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425 (2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -. T., Chang, C. -. Y., Su, M. -. T., Kuo, W. -. C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014 (2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer’s disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313 (2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020 (2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639 (2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. . Laboratory culture of Drosophila. 2a, 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. . Drosophila: a laboratory handbook. , (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).

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Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).
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