Microscopia elettronica a scansione (SEM) Protocolli per problematico Plant, oomicete, e campioni fungine

Summary

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Abstract

I problemi più comuni nel trattamento dei campioni biologici per le osservazioni con il microscopio elettronico a scansione (SEM) includono il collasso delle cellule, il trattamento di campioni provenienti da microambienti umidi e la distruzione delle cellule. Utilizzando i giovani tessuti floreali, cisti oomiceti e spore di funghi (Agaricales) come esempi, i protocolli specifici per trattare i campioni delicati sono descritte qui che superano alcune delle principali sfide nel trattamento del campione per l'acquisizione di immagini sotto il SEM.

meristemi floreali fissate con FAA (formalina-acetico-alcol) ed elaborate con la Critical Point Dryer (CPD) non veniva visualizzato crollati pareti cellulari o organi distorti. Questi risultati sono cruciali per la ricostruzione dello sviluppo floreale. Un simile trattamento CPD-based dei campioni microambienti umidi, come le cisti oomiceti glutaraldeide fisso, è ottimale per testare la crescita differenziale di caratteristiche diagnostiche (ad esempio, le spine cisti) su diversi tipi di dobstrates. La distruzione delle cellule nutrici collegati a spore di funghi è stato evitato dopo la reidratazione, la disidratazione, e il trattamento CPD, un passo importante per ulteriori studi funzionali di queste cellule.

I protocolli descritti qui rappresentano a basso costo e le alternative rapide per l'acquisizione di immagini di buona qualità per ricostruire i processi di crescita e di studiare le caratteristiche diagnostiche.

Introduction

In biologia, l'uso di microscopia elettronica a scansione (SEM) è stato esteso a studi di evoluzione strutturale, morfologia comparativa sviluppo degli organi, e la caratterizzazione di popolazioni o specie ^1. Con la sua vista bidimensionale di strutture microscopiche, aree come micromorfologia e sistematica beneficiato dal SEM tecnica progressi a partire dalla seconda metà del 20 ^° secolo. Ad esempio, l'introduzione della metodologia di rivestimento sputtering nel 1970 resa possibile osservazioni di materiali delicati quali apici dei germogli e fiori migliorando l'imaging del tessuto non conduttivi ^{2, 3.} SEM utilizza elettroni emessi dalla superficie del campione per riprodurre la topografia in un ambiente ad alto vuoto ^4.

Gli studi che coinvolgono SEM sono focalizzati sia l'inferenza di caratteri strutturali e la ricostruzione di growtprocessi h. Nuovi personaggi strutturali rilevanti per la tassonomia e sistematica di una vasta gamma di organismi sono stati scoperti da osservazioni SEM. Ad esempio, i tratti vegetali utilizzati per la diagnosi specie o di classificazioni supraspecific, come ad esempio i pozzi vestured di legno _{^5, la} stigmatizzazione della diversità ^6, nettario e floreale morfologia ^{7, 8,} dettagli tricomi ^9, e grani di polline ^{10, 11,} non può essere visualizzato correttamente senza SEM. Osservazioni di successo con SEM convenzionale sono stati raggiunti anche per lungo tempo gli organismi fissati in formalina ¹² e vegetale erbario esemplari ^13.

D'altra parte, studi di ricostruzione dei processi di crescita mediante SEM coinvolgono un'ampia gamma di argomenti, quali lo sviluppo dell'organo ^14, infeZIONI indotte da batteri ^15, pianta radice fisiologia ^16, meccanismi di attacco del parassita-ospite ^{17, 18,} gli effetti della droga sui parassiti ^19, mycoparasitism e antibiosi ^{20, 21,} la crescita malformazioni ^22, sviluppo comparativa di individui selvatici e mutanti ^23, e interi cicli di vita ^24. Sebbene microscopi a scansione ambientale elettroni (ESEM) ²⁵ possono avere importanti vantaggi per l'osservazione di campioni biologici umidi nei processi di crescita, materiale delicato può ancora essere compromessa anche in condizioni di basso vuoto della ESEM), e devono essere trattati adeguatamente per evitare perdite di pregevole osservazione morfologica.

In questo lavoro, una revisione dei protocolli specifici per SEM osservazione di tre difftipi diversi di campioni è presentato: meristemi floreali, oomiceti (Saprolegnia), e materiale fungino. Questi protocolli compilare l'esperienza dei nostri studi precedenti SEM-base ^{26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,} dove sono stati trovati difficoltà specifiche e soluzioni alternative. Nel caso di impianti di sviluppo comparativo e studi strutturali, l'uso di SEM ha iniziato nel 1970 ^{34, 35,} e da allora, i ricercatori hanno scoperto che certe caratteristiche floreali sono più labili di quanto si pensasse ^36. Ricostruzione di sviluppo floreale comporta la cattura di tutte le fasi tra giovani meristemi floreali e antesi. Per raggiungere questo obiettivo, è essential che la topografia del campione e l'integrità parete cellulare non sono compromesse dopo la fissazione e successiva disidratazione. I giovani meristemi floreali sono particolarmente vulnerabili al collasso della parete cellulare (figure 1a, 1b). Allo stesso modo, le strutture delicate come nettarii, petali, stimmi e sporangi richiedono protocolli efficaci e undamaging. Questa review riassume un protocollo ottimale per mantenere giovani e delicati tessuti intatti per l'imaging SEM.

Nel caso dei oomiceti (Stramenopiles), uno dei gruppi più diversi e diffusi di parassiti, con padroni di casa che vanno dai microbi e piante per invertebrati e vertebrati ³⁷ – ci sono spore che crescono e si sviluppano in un ambiente umido. Questa condizione rappresenta una sfida per l'osservazione SEM perché le spore hanno bisogno di un supporto adeguato non è adatto per protocolli standard SEM. Tra le oomiceti, specie di Saprolegnia sono di particolare interesse perché can causare gravi riduzioni di acquacoltura, la pesca, e le popolazioni di anfibi ^38. Caratteristiche micromorfologici, come ad esempio le spine uncinate di cisti, sono stati trovati per essere utile per identificare le specie di Saprolegnia, che è fondamentale per stabilire i controlli di infezione e potenziali trattamenti ^39. Qui, vi è un protocollo sperimentale di confrontare i modelli di crescita colonna di cisti su diversi substrati e per manipolare il campione per la preparazione critica punto asciugatrice (CPD) e successiva osservazione SEM.

In un terzo caso, ci sono risultati interessanti, che salgono dopo un controllo delle spore dei funghi Phellorinia Herculanea f. f stellata. nova (Agaricales) ^31. Insieme con le spore, un gruppo di celle di vivai inaspettati stato identificato sotto la SEM. Con i protocolli tradizionali precedenti e materiale non trattato, le cellule venivano infermiere out completamente crollato (Figura 1c). Ulteriori inferenze su particolari tessuti associati alle spore possono essere realizzati con semplici ma cruciali modifiche agli approcci standard qui descritti (Figura 1d).

In questa recensione, ci sono protocolli dettagliati SEM che possono essere utilizzati per affrontare diversi problemi associati con l'osservazione SEM negli angiosperme, oomiceti, e Agaricales, come ad esempio il collasso delle cellule e restringimento dei tessuti meristematico, la crescita non ottimale di spine cisti, e la distruzione di tessuti effimere, rispettivamente.

Figura 1: Confronto tra campioni trattati, senza (a, c) e (b, d) il protocollo FAA-etanolo-CPD. (A – b) gemme floreali di Anacyclus clavatus, a metà dello sviluppo. Bud trattato con tetrossido di osmio ^{46 <}/ sup> (a) e Bud trattati con il protocollo FAA-CPD (b). (C – d) le cellule infermiera con spore di Phellorinia Herculanea f. Stellata. Campioni essiccati senza alcun trattamento (c) e con il protocollo qui descritto per Agaricales (d). Le spore in arancione. Bilancia: (ab) 100 micron, (cd) 50 micron. Le foto sono state scattate da Y. Ruiz-León. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Protocol

NOTA: Questo protocollo comprende sei sezioni principali, tre dedicati ad organismi specifici (sezioni 1-3), e tre descrivono le procedure comuni a tutti (4-6). Asterischi (*) indicano passi modificati dagli sperimentatori. 1. Studi di sviluppo e di strutture vegetali completamente formati Raccolta e la fissazione Se il materiale vegetale viene raccolto in un luogo senza accesso ad una cappa, introdurre e immergere il materiale in 70% di etanolo in provet…

Representative Results

Sviluppo floreale e la fissazione di sviluppo e strutture vegetali completamente formato Utilizzando il protocollo FAA-CPD descritto qui, giovani e mature tessuti vegetali sono perfettamente fissati e disidratati per l'imaging SEM. Processi come lo sviluppo floreale possono essere ricostruiti, perché la topografia e la forma delle gemme non sia falsata da cellule restringimento (Figure 1b, 1d, 4a-f). Le str…

Discussion

Per quanto riguarda i protocolli standard SEM, le procedure qui presentati sono relativamente rapido, facile da seguire, e le metodologie a basso costo. A seconda della quantità di campioni e sulla facilità di lavorazione, ci vogliono quattro o cinque giorni per acquisire immagini di buona qualità. Compreso adeguate misure di sicurezza per la CPD e il funzionamento SEM, le procedure sono facili da gestire. Particolare cautela deve essere assunto con formalina e la glutaraldeide (vedere i passaggi da 1.1.1 a 1.1.3 e 2…

Materials

Acetic acid	No specific supplier		Skin irritation, eye irritation
aluminium stubs	Ted Pella, Inc.	16221	www.tedpella.com
Centrifuge tubes	No specific supplier
Critical Point Dryer	Polaron Quatum Technologies	CPD7501
D (+) Glucose	Merck	1,083,421,000
Double sided sellotape	No specific supplier
Ethanol absolute	No specific supplier.		Flammable
European bacteriological agar	Conda	1800.00	www.condalab.com
Filter paper	No specific supplier
Forceps	No specific supplier
Formalin 4%	No specific supplier.		Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable
Glass cover slips	No specific supplier
Glass hermetic container	No specific supplier
Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611  (L)	Dismadel S.L.	3336	www.dismadel.com
Mycological peptone	Conda	1922.00	www.condalab.com
needles	No specific supplier
Petri dishes	No specific supplier
Plastic containers	No specific supplier
Sample holder with lid  for the critical point dryer	Ted Pella, Inc.	4591	www.tedpella.com
scalpels	No specific supplier
Scanning Electron Microscope	Hitachi	S3000N
Software for SEM
Solution A: NaH2PO4
Solution B: Na2HPO4
Specimen holders	No specific supplier
Sputter coater	Balzers	SCD 004
Stereomicroscope	No specific supplier
Transmission Electron Microscope (TEM) grids	Electron Microscopy Sciences	G200 (Square Mesh)	www.emsdiassum.com
Tweezers	No specific supplier