問題のあるプラント、卵菌類、および真菌サンプルのための電子顕微鏡（SEM）プロトコルをスキャン
Summary
Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.
Abstract
走査型電子顕微鏡（SEM）による観察のための生物学的サンプルの処理における一般的な問題は、細胞崩壊、湿式微環境からのサンプルを処理し、細胞の破壊を含みます。 SEM下の画像キャプチャのための試料処理における主な課題のいくつかを克服するため、ここで説明されているデリケートなサンプルを処理するために、特定のプロトコルを若い花の組織、卵菌類嚢胞、および例などの真菌胞子（ハラタケ目）を使用します。
花分裂組織FAA（ホルマリン酢酸 – アルコール）で固定し、臨界点乾燥機（CPD）で処理が崩壊セルラー壁や歪ん臓器が表示されませんでした。これらの結果は、花の開発の復興のために非常に重要です。このようなグルタルアルデヒド固定卵菌類嚢胞等の湿式微小環境からのサンプルの同様のCPDに基づく治療、suコマンドの異なる種類の診断特性（ 例えば、嚢胞棘）の差動成長をテストすることが最適ですbstrates。カビの胞子に取り付けられたナース細胞の破壊を再水和、脱水、及びCPD処理、これらの細胞のさらなる機能研究のための重要なステップの後に回避されました。
ここでの詳細なプロトコルは、成長プロセスを再構築し、診断特性を研究するために、良好な品質の画像を取得するための低コストで迅速な代替物を表します。
Introduction
生物学では、走査型電子顕微鏡（SEM）の使用は、構造進化の研究、比較形態、器官の発達、及び集団又は種1の特徴に拡張されています。微細構造体の、その2次元図では、このような微細形態や系統などの分野は、20 世紀後半以降のSEM技術の進歩から利益を得ました。例えば、1970年代にスパッタコーティング方法論の導入は、このような非導電性組織2、3のイメージングを高める茎頂や花などの繊細な素材の可能な観察を行いました。 SEMは、高真空環境4の形状を再現するために、試料の表面から放出された電子を使用します。
SEMを含む研究は、構造的な文字の推論とgrowtの復興の両方に重点を置いています時間プロセス。広範囲の生物の分類と系統に関連する新しい構造的な文字は、SEM観察から発見されています。例えば、このような木材5、柱頭の多様性6、蜜腺と花の形態7、8の衣をまとったピットなどの種の診断またはsupraspecific分類ごとに使用される植物の形質、トライコームの詳細9、および花粉粒10、11は 、適切にせずに可視化することはできませんSEM。従来のSEMで成功観察はまた、長時間のホルマリン固定生物12と植物植物標本13のために達成されています。
一方、SEMを用いた成長プロセスの再構成の研究は、このような臓器の発達14、infeなどのトピックの広い範囲を含みます細菌15、植物の根生理学16、寄生虫ホスト接続機構17、18、寄生虫19、mycoparasitismおよび抗生20、21、成長奇形22、野生および変異個体23の比較開発、およびライフサイクル全体を上薬の効果によって誘発されるctions 24。環境走査型電子顕微鏡（ESEM）25は、成長プロセスにおいて湿潤生体試料の観察に重要な利点を有していてもよいが、繊細な材料が依然としてもESEM）の低真空状態で妥協し、損失を回避するために適切に処理する必要があることができます貴重な形態学的観察。
本論文では、3差分のSEM観察のための特定のプロトコルのレビューではサンプルのerent種類が提示されている：花の分裂組織、卵菌類（ ミズカビ ）、および真菌物質を。これらのプロトコルは、特定の困難や代替案が見出されている我々の以前のSEMベースの研究26、27、28、29、30、31、32、33、の経験をコンパイルします。植物の比較発達と構造研究の場合には、SEMの使用は、1970年代34、35で開始して以来、研究者は、特定の花の特徴は、以前に36を考えられていたよりも不安定であることを発見しました。花の開発の復興は、若い花の分裂組織と開花間のすべての段階の捕獲を伴います。この目的を達するためには、ESSEあります試料のトポグラフィー及び細胞壁の完全性は、固定およびその後の脱水後に損なわれないことをntial。若い花分裂組織の細胞壁の崩壊に対して特に脆弱である（ 図1A、1B）。同様に、蜜腺、花弁、柱頭および胞子嚢のような繊細な構造が効果的とundamagingプロトコルを必要とします。このレビューは、SEMイメージングのためそのまま若くて繊細な組織を維持するための最適なプロトコルをまとめたものです。
卵菌類の微生物や植物からの無脊椎動物と脊椎動物37に至るまでのホストと寄生虫の最も多様かつ広範なグループの（ストラメノパイル） -オンの場合、 -成長し、湿潤環境での開発胞子があります。胞子は、標準的なSEMプロトコルには適していない適切な基板を必要とするので、この条件は、SEM観察のための課題です。彼らはcaのため卵菌類のうち、 サプロレグニアの種は特に重要ですnは水産養殖、漁業、および両生類の個体数38で深刻な減少を引き起こします。そのような嚢胞のフック棘などの微細形態の特徴は、感染の制御および潜在的な治療法39を確立することが基本であるサプロレグニア、の種を同定するのに有用であることが見出されています。ここでは、異なる基板上の嚢胞の脊椎の成長パターンを比較し、臨界点乾燥（CPD）の調製とその後のSEM観察用の試料を操作するための実験プロトコルがあります。
第三のケースでは、真菌のPhelloriniaのherculanea fの胞子の検査後に思い付いた興味深い調査結果があります。 stellataの F。新星（ハラタケ目）31。一緒に胞子で、予想外の保育園の細胞のグループがSEMで確認されました。以前の伝統的なプロトコルおよび未処理材料で、ナース細胞は、OUを来ましたtは完全に（ 図1c）を崩壊しました。胞子に関連する特定の組織についてのさらなる推論は、ここで説明する（ 図1D）は、標準的なアプローチにシンプルだが非常に重要な変更を加えて行うことができます。
このレビューでは、このような細胞の崩壊と分裂組織の縮小、嚢胞棘の非最適な成長、および破壊など、さまざまな被子植物におけるSEM観察に関連する問題、卵菌類、およびハラタケ目に対処するために使用することができ、詳細なSEMプロトコルが存在し、それぞれはかない組織。
図1（C）なしで（B、D）プロトコルFAAエタノール-CPDで処理したサンプルの比較。 （ – b）は Anacyclusのclavatus、ミッド開発の花蕾。バドは<四酸化オスミウム46で処理されました/ SUP>（a）およびFAA-CPDプロトコル（B）で処理した出芽。 （C – D）Phelloriniaのherculanea fの胞子とナース細胞。 stellata。任意の治療（C）なしで、ここハラタケ目（d）に記載のプロトコルを用いてサンプルを乾燥させました。オレンジ色で胞子。スケール：（AB）が100μm、（CD）50μmです。写真はY.ルイス・レオンによって撮影されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
標準的なSEMプロトコルに関しては、ここで紹介する手順は、比較的、迅速な追随しやすく、かつ低コストの方法論を含みます。試料の量と処理の容易さに応じて、良好な品質の画像を取得するために4〜5日かかります。 CPDとSEMの操作のための適切な安全措置を含め、手続きは、取り扱いが容易です。特に注意が（1.1.3およびプロトコルの2.1.5へのステップ1.1.1を参照）、ホルマリンやグルタル?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、このマニュアルでは、唯一の著者の見解を反映し、欧州委員会は、情報を挙げることができる任意の使用のための責任を負うことはできません付与契約番号634429.の下で、欧州連合（EU）のホライゾン2020年研究と技術革新プログラムから資金提供を受けていますその中に含まれます。我々はまた、レアルハルディンボタニコ、CSIC製の資金拠出を認めます。 SRはサプロレグニアで彼女の研究をサポートするため、欧州連合（EU）[ITN-SAPRO-238550]に感謝しています。我々はまた、親切Phelloriniaのherculanea画像を提供し、処理サンプルについてB.プエヨ（図5）のためのフランシスコカロンジュに感謝したいと思います。すべての画像はマドリードでレアルハルディンボタニコ-CSICのSEMサービスによって撮影されました。
Materials
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D (+) Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier. | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier. | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
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