Escaneado de Protocolos de Microscopía Electrónica (SEM) para la Problemática de la planta, Oomycete, y muestras de hongos
Summary
Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.
Abstract
Los problemas más comunes en el procesamiento de muestras biológicas para observaciones con el microscopio electrónico de barrido (SEM) incluyen colapso celular, el tratamiento de muestras de microambientes húmedos y destrucción de las células. El uso de tejidos florales jóvenes, quistes oomycete y esporas de hongos (Agaricales) como ejemplos, los protocolos específicos para procesar las muestras delicadas están descritos aquí que superan algunos de los principales desafíos en el tratamiento de la muestra para la captura de imágenes bajo el SEM.
meristemos florales fijos con la FAA (formalina-acético-alcohol) y se procesa con el Punto Crítico Secadora (CPD) no mostraron colapsaron paredes celulares u órganos distorsionadas. Estos resultados son cruciales para la reconstrucción del desarrollo floral. Un tratamiento basado en la CPD similar de muestras de microambientes húmedos, como los quistes oomycete fijados con glutaraldehído, es óptimo para poner a prueba el crecimiento diferencial de las características de diagnóstico (por ejemplo, las espinas del quiste) en diferentes tipos de Dobstrates. La destrucción de células de la enfermera adjunta a esporas de hongos se evitó después de la rehidratación, la deshidratación y el tratamiento de CPD, un paso importante para los estudios más funcionales de estas células.
Los protocolos detallados aquí representan bajo costo y alternativas rápidas para la adquisición de imágenes de buena calidad para reconstruir los procesos de crecimiento y estudiar sus características de diagnóstico.
Introduction
En biología, el uso de la microscopía electrónica de barrido (SEM) se ha extendido a los estudios de la evolución estructural, la morfología comparativa, el desarrollo de órganos, y la caracterización de las poblaciones o especies 1. Con su vista bidimensional de estructuras microscópicas, áreas como la micromorfología y sistemática se beneficiaron de los avances de la técnica SEM desde la segunda mitad del siglo 20. Por ejemplo, la introducción de la metodología de revestimiento por bombardeo iónico en la década de 1970 hizo posibles observaciones de materiales delicados, como los brotes apicales y flores que potencien la capacidad de formación de imágenes de los tejidos no conductores 2, 3. SEM utiliza electrones expulsados de la superficie de la muestra para reproducir la topografía en un entorno de alto vacío 4.
Los estudios que implican SEM se centran tanto en la inferencia de caracteres estructurales y la reconstrucción de growtprocesos h. caracteres estructurales nuevos relevantes a la taxonomía y sistemática de una amplia gama de organismos se han descubierto a partir de observaciones de SEM. Por ejemplo, características de las plantas utilizadas para el diagnóstico de las especies o las clasificaciones supraespecíficas, tales como las punteaduras de madera 5, la diversidad estigma 6, morfología nectario y florales 7, 8, detalles de tricomas 9, y los granos de polen de 10, 11, no puede visualizarse de forma adecuada y sin SEM. Observaciones exitosas con SEM convencional también se han logrado para los organismos fijados en formalina 12 desde hace mucho tiempo y especímenes de herbario de plantas 13.
Por otra parte, los estudios de reconstrucción de los procesos de crecimiento utilizando SEM implican una amplia gama de temas, tales como el desarrollo de órganos 14, infecciones inducidos por las bacterias 15, planta de raíz fisiología 16, mecanismos de fijación parásito-hospedador 17, 18, efectos de medicamentos en los parásitos 19, micoparasitismo y antibiosis 20, 21, malformación crecimiento del 22, de desarrollo comparativo de individuos salvajes y mutantes 23, y ciclos de vida completos 24. Aunque los microscopios electrónicos de barrido ambiental (ESEM) 25 pueden tener ventajas importantes para la observación de muestras biológicas húmedas en los procesos de crecimiento, material delicado todavía podrá verse comprometido incluso en la condición de bajo vacío del ESEM), y necesitan ser procesados adecuadamente para evitar la pérdida de valiosa observación morfológica.
En este trabajo, una revisión de los protocolos específicos para la observación SEM de tres diffSe presenta Erent tipos de muestras: meristemos florales, oomicetos (Saprolegnia), y material fúngico. Estos protocolos compilar la experiencia de nuestros estudios anteriores basados en SEM 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, donde se han encontrado dificultades específicas y soluciones alternativas. En el caso de la planta comparada estudios estructurales y de desarrollo, el uso de SEM se inició en la década de 1970 34, 35, y desde entonces, los investigadores descubrieron que ciertas características florales son más lábil que se pensaba anteriormente 36. Reconstrucción del desarrollo floral implica la captura de todas las etapas entre los meristemos florales jóvenes y antesis. Para alcanzar este objetivo, es essential que la topografía de la muestra y la integridad de la pared celular no se vean comprometidos después de la fijación y la subsiguiente deshidratación. Meristemos florales jóvenes son particularmente vulnerables al colapso de la pared celular (Figuras 1a, 1b). Del mismo modo, las estructuras delicadas como nectarios, pétalos, estigma y esporangios requieren protocolos eficaces y no perjudiquen. Esta revisión resume un protocolo óptimo para mantener los tejidos jóvenes y delicadas intactas para obtener imágenes de SEM.
En el caso de los oomicetos (stramenopiles), uno de los grupos más diversos y generalizadas de los parásitos, con anfitriones que van desde los microbios y plantas de invertebrados y vertebrados 37 – hay esporas que crecen y se desarrollan en un ambiente húmedo. Esta condición representa un desafío para la observación SEM porque las esporas necesitan un sustrato adecuado no es adecuado para protocolos estándar SEM. Entre los oomicetos, especies de Saprolegnia son de particular interés debido a que can causar reducciones severas en la acuicultura, la pesca y las poblaciones de anfibios 38. Características micromorfológicos, tales como las espinas de gancho de los quistes, se han encontrado para ser útil para identificar especies de Saprolegnia, que es fundamental para establecer los controles de infección y los tratamientos potenciales 39. Aquí, hay un protocolo experimental para comparar los patrones de crecimiento de la columna vertebral de los quistes en diferentes sustratos y manipular la muestra para la preparación de los Puntos Críticos de secador (CPD) y la posterior observación SEM.
En un tercer caso, hay hallazgos más interesantes que surgieron después de una inspección de las esporas de los hongos Phellorinia Herculanea f. f stellata. nova (Agaricales) 31. Junto con las esporas, un grupo de células de vivero inesperados se identificó bajo el SEM. Con los protocolos tradicionales anteriores y material sin tratar, las células enfermera entró out se derrumbó por completo (Figura 1c). Más inferencias sobre tejidos particulares asociados a las esporas se pueden hacer con las modificaciones simples pero cruciales a los enfoques estándar descritos aquí (Figura 1D).
En esta revisión, hay protocolos detallados SEM que se pueden utilizar para hacer frente a diferentes problemas asociados con la observación SEM en las angiospermas, oomicetos, y Agaricales, tales como el colapso celular y la contracción del tejido meristemático, el crecimiento no óptima de las espinas del quiste, y la destrucción de tejidos efímeras, respectivamente.
Figura 1: Comparación de las muestras tratadas y sin (a, c) y con (b, d) el protocolo de la FAA-etanol-CPD. (A – b) yemas florales de Anacyclus clavatus, a mitad de desarrollo. Bud tratada con tetróxido de osmio 46 </ sup> (a) y Bud tratados con el protocolo de la FAA-CPD (b). (C – d) las células de la enfermera con esporas de Phellorinia Herculanea f. stellata. Secado muestras sin ningún tratamiento (c) y con el protocolo aquí descrito para Agaricales (d). Las esporas de color naranja. Escalas: (ab) 100 m, (cd) 50 micras. Las fotografías fueron tomadas por Y. Ruiz-León. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con respecto a los protocolos estándar SEM, los procedimientos que aquí se presentan son relativamente rápido, fácil de seguir, y metodologías de bajo costo. Dependiendo de la cantidad de muestras y en la facilidad de procesamiento, se tarda de cuatro a cinco días para adquirir imágenes de buena calidad. Incluidas las precauciones de seguridad adecuadas para el CPD y el funcionamiento SEM, los procedimientos son fáciles de manejar. Particular, se debe tener cuidado con formalina y el glutaraldehído (consulte lo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del acuerdo de subvención Nº 634429. Esta publicación es responsabilidad exclusiva de su autor, y la Comisión Europea no se hace responsable del uso que pueda hacerse de la información contenida en el mismo. También reconocemos la aportación económica realizada por el Real Jardín Botánico, CSIC. SR agradece a la Unión Europea [ITN-SAPRO-238550] por el apoyo de su investigación en Saprolegnia. También queremos dar las gracias a Francisco Calonge por la amabilidad de proporcionar las imágenes Herculanea Phellorinia y B. Pueyo para el procesamiento de muestras (Figura 5). Todas las imágenes fueron tomadas por el servicio de SEM en el Real Jardín Botánico-CSIC en Madrid.
Materials
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D (+) Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier. | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier. | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
Riferimenti
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
- Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
- Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
- Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
- Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
- Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
- Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
- Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
- Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
- Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
- Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
- García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
- Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
- Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
- Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
- Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
- Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
- Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
- Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
- Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
- Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
- Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
- Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
- Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
- Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
- Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
- Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
- Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
- Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
- Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
- Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
- Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
- Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
- Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
- van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
- Johansen, D. A. . Plant microtechnique. , (1940).
- Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
- Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
- Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
- Echlin, P. . Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , (2009).
- Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
- Rezinciuc, S. . The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , (2013).
