Svepelektronmikroskopi (SEM) Protokoll för Problematiskt Plant, Algsvampar, och Svamp Prover
Summary
Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.
Abstract
Vanliga problem i bearbetning av biologiska prover för observationer med svepelektronmikroskop (SEM) innefattar cellkollaps, behandling av prover från våta mikromiljöer och celldöd. Använda unga blommor vävnader, Algsvampar cystor och svampsporer (Agaricales) som exempel, specifika protokoll för att behandla känsliga prover beskrivs här som övervinner några av de största utmaningarna i provbehandling för bildtagning under SEM.
Blommor meristems fast med FAA (Formalin Ättiksyra-alkohol) och behandlas med den kritiska punkten Dryer (CPD) inte visa kollapsade cellväggar eller förvrängda organ. Dessa resultat är avgörande för återuppbyggnaden av blommor utveckling. En liknande CPD-baserad behandling av prover från våta mikromiljöer, såsom glutaraldehydfixerade Algsvampar cystor, är optimalt att testa differential tillväxten av diagnostiska egenskaperna (t.ex., cysta ryggar) på olika typer av SUbstrates. Förstörelse av sjuksköterska celler fästa till svampsporer undveks efter rehydrering, uttorkning, och CPD behandling, ett viktigt steg för ytterligare funktionella studier av dessa celler.
Protokollen som beskrivs här representerar låg kostnad och snabbt alternativ för förvärv av god kvalitet bilder att rekonstruera tillväxtprocesser och att studera diagnostiska egenskaper.
Introduction
I biologi, har användningen av svepelektronmikroskopi (SEM) utsträckts till studier av strukturella utvecklingen, jämförande morfologi, organutveckling, och karakterisering av populationer eller arter 1. Med två-dimensionell bild av mikroskopiska strukturer, områden såsom Mikromorfologi och systematik dragit nytta SEM förskott teknik sedan andra halvan av 20-talet. Till exempel införandet av tronsputterbeläggningsmetod på 1970-talet gjorde möjliga observationer av ömtåliga material, såsom skott spetsar och blommor som ökar avbildning av icke-ledande vävnader 2, 3. SEM använder elektroner utkastade från ytan av provet för att återskapa topografin i en hög vakuum 4.
Studier med SEM fokuseras i både slutsats strukturella karaktärer och återuppbyggnaden av growth processer. Nya strukturella tecken som är relevanta för taxonomi och systematik av ett brett spektrum av organismer har upptäckts från SEM observationer. Till exempel, växtegenskaper som används för arter diagnos eller supraspecific klassificeringar, såsom vestured gropar av trä 5, stigma mångfald 6, Nectary och blommig morfologi 7, 8, trichome detaljer 9 och pollenkorn 10, 11, kan inte korrekt visualiseras utan SEM. Framgångsrika observationer med konventionell SEM har också uppnåtts för lång tid formalinfixerade organismer 12 och växt herbarieexemplar 13.
Å andra sidan, studier av rekonstruktion av tillväxtprocesser som använder SEM innebär ett brett spektrum av ämnen, såsom organutveckling 14, infeTGÄRDER inducerade av bakterier 15, växtrötter fysiologi 16, parasit-värd fästmekanismer 17, 18, drog effekter på parasiter 19, mycoparasitism och antibiosis 20, 21, tillväxt missbildning 22, jämförande utveckling av vilda och muterade individer 23, och hela livscykler 24. Även svepelektronmikroskop (ESEM) 25 kan ha viktiga fördelar för observation av våta biologiska prover i tillväxtprocesser, kan känsliga material fortfarande äventyras även i lågvakuum skick ESEM), och måste behandlas på lämpligt sätt för att undvika förlust värdefulla morfologiska observation.
I detta papper, en översyn av särskilda regler för SEM-observation av tre difftekniker när typer av prover presenteras blom meristem, oomyceter (Saprolegnia) och svampmaterial. Dessa protokoll sammanställa erfarenheterna från våra tidigare SEM-baserade studier 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, där särskilda svårigheter och alternativa lösningar har påträffats. När det gäller anläggningen jämförande utvecklings- och strukturstudier, användningen av SEM startade på 1970-talet 34, 35, och sedan upptäckte forskare att vissa blommor funktioner är mer labil än man tidigare trott 36. Rekonstruktion av blommor utveckling innebär fångst av alla stadier mellan unga blom meristems och blomningen. För att nå detta mål är det essential att prov topografi och cellväggen integritet inte äventyras efter fixering och efterföljande uttorkning. Unga blommor meristems är särskilt känsliga för cellväggen kollapsar (figurerna 1a, 1b). På samma sätt, känsliga strukturer såsom nectaries, kronblad, pistillmärken och sporangier kräver effektiva och undamaging protokoll. Det här omdömet sammanfattar en optimal protokoll för att hålla unga och känsliga vävnader intakt för SEM avbildning.
I fallet med Oomycetes (Stramenopiles) -en av de mest skiftande och omfattande grupper av parasiter, med värdar som sträcker sig från mikrober och växter till ryggradslösa djur och ryggradsdjur 37 – det finns sporer som växer och utvecklas i en fuktig miljö. Detta tillstånd utgör en utmaning för SEM-observation eftersom sporerna behöver en tillräckligt underlag inte lämpar sig för vanliga SEM-protokoll. Bland Oomycetes, arter av Saprolegnia är av särskilt intresse eftersom de can orsaka allvarliga minskningar i vattenbruk, fiske och groddjurspopulationer 38. Mikromorfologiska egenskaper, såsom krok ryggar av cystor, har visat sig vara användbara för att identifiera arter av Saprolegnia, som är grundläggande för att fastställa infektionskontroller och potentiella behandlingar 39. Här, det finns ett experimentellt protokoll för att jämföra mönster av ryggraden tillväxt av cystor på olika substrat och för att manipulera provet för kritisk punkt tork (CPD) beredning och efterföljande SEM-observation.
I ett tredje fall, det finns intressanta resultat som kom upp efter en inspektion av sporer av svampen phellorinia herculanea f. stellata f. nova (Agaricales) 31. Tillsammans med sporer, var en grupp av oväntade plantskola celler identifierades under SEM. Med tidigare traditionella protokoll och obehandlat material, kom sjuksköterskan cellerna out fullständigt kollapsat (figur 1c). Ytterligare slutsatser om särskilda vävnader associerade till sporerna kan göras med enkla men viktiga ändringar av de standardmetoder som beskrivs här (figur 1d).
I denna översyn finns detaljerade SEM protokoll som kan användas för att ta itu med olika problem i samband med SEM-observation i angiospermer, Oomycetes och Agaricales, såsom cellkollaps och meristemvävnad krympning, icke-optimal tillväxt av cysta ryggar, och förstörelse av efemära vävnader, respektive.
Figur 1: Jämförelse av prover som behandlats utan (a, c) och (b, d) protokollet FAA-etanol-CPD. (A – b) Blom knoppar av Anacyclus clavatus, mid-utveckling. Knopp behandlades med osmiumtetroxid 46 </ sup> (a) och Bud behandlades med FAA-CPD-protokollet (b). (C – d) Nurse celler med sporer av phellorinia herculanea f. stellata. Torkade prover utan någon behandling (c) och med det protokoll som beskrivs här för Agaricales (d). Sporer i orange. Skalor: (ab) 100 ^ m, (cd) 50 | j, m. Bilder togs av Y. Ruiz-León. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
Representative Results
Discussion
När det gäller vanliga SEM protokoll, de förfaranden som presenteras här omfattar relativt snabb, lätt att följa, och låg kostnad metoder. Beroende på mängden av prov och på den lättare bearbetning, det tar fyra till fem dagar för att få bilder av god kvalitet. Inklusive lämpliga säkerhetsåtgärder för CPD och SEM drift förfarandena är lätta att hantera. Särskild försiktighet bör iakttas med formalin och glutaraldehyd (se steg 1.1.1 till 1.1.3 och 2.1.5 i protokollet). Det finns vissa steg där, o…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt har fått stöd från EU: s Horisont 2020 forsknings- och innovationsprogram enligt bidragsavtal nr 634429. Denna publikation ansvarar endast upphovsmannen, och kommissionen kan inte hållas ansvarig för någon användning som kan göras av informationen som finns däri. Vi erkänner också det finansiella bidraget från Real Jardín Botánico, CSIC. SR är tacksam mot Europeiska unionen [ITN-Sapro-238.550] för att stödja sin forskning i Saprolegnia. Vi vill också tacka Francisco Calonge för vänligt ge phellorinia herculanea bilder och B. Pueyo för bearbetning prover (Figur 5). Alla bilder är tagna av SEM tjänsten på Real Jardín Botánico-CSIC i Madrid.
Materials
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D (+) Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier. | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier. | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
Riferimenti
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
- Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
- Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
- Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
- Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
- Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
- Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
- Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
- Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
- Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
- Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
- García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
- Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
- Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
- Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
- Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
- Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
- Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
- Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
- Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
- Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
- Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
- Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
- Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
- Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
- Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
- Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
- Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
- Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
- Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
- Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
- Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
- Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
- Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
- van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
- Johansen, D. A. . Plant microtechnique. , (1940).
- Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
- Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
- Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
- Echlin, P. . Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , (2009).
- Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
- Rezinciuc, S. . The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , (2013).
