Xenopus ovociti: Metodi ottimizzate per microiniezione, la rimozione di strati di cellule follicolari e cambiamenti soluzione veloce in esperimenti di elettrofisiologia
Summary
Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.
Abstract
L'oocita di Xenopus come un sistema di espressione eterologa di proteine, è stato descritto da Gurdon et al. 1 ed è stato ampiamente utilizzato dalla sua scoperta (Riferimenti 2 – 3, e riferimenti ivi). Una caratteristica che rende l'ovocita attraente per l'espressione canale estero è la scarsa abbondanza di canali ionici endogeni 4. Questo sistema di espressione è dimostrato utile per la caratterizzazione di molte proteine, tra i quali canali ionici ligando-dipendenti.
L'espressione dei recettori GABA in oociti di Xenopus e la loro caratterizzazione funzionale è descritto qui, compreso l'isolamento degli ovociti, microiniezioni con cRNA, la rimozione di strati di cellule follicolari e soluzione cambia veloci esperimenti elettrofisiologici. Le procedure sono state ottimizzate in questo laboratorio 5,6 e si discostano da quelli utilizzati di routine 7-9. Tradizionalmente, gli ovociti denudati vengono preparaticon un trattamento prolungato collagenasi di lobi ovariche a temperatura ambiente, e questi ovociti denudati sono microiniezione con mRNA. Utilizzando i metodi ottimizzati, diverse proteine di membrana sono state espresse e studiato con questo sistema, come ricombinanti recettori GABA A 10-12, canali del cloro ricombinanti umani 13, canali di potassio trypanosome 14, e un trasportatore myo-inositolo 15, 16.
I metodi qui descritti possono essere applicati alla espressione di qualsiasi proteina di scelta in oociti di Xenopus, e la variazione rapida soluzione possono essere utilizzati per studiare altri canali ionici ligando-dipendenti.
Introduction
Ovociti di Xenopus sono ampiamente utilizzati come un sistema di espressione (Riferimenti 2 – 3, e riferimenti ivi). Essi sono in grado di assemblare correttamente e integrare proteine multisubunit funzionalmente attivi nelle loro membrane plasmatiche. Utilizzando questo sistema, è possibile indagare funzionalmente proteine di membrana da solo o in combinazione con altre proteine, per studiare le proprietà dei mutanti, chimerici, o proteine concatenati, e allo schermo potenziali farmaci.
Vantaggi di usare ovociti rispetto ad altri sistemi di espressione eterologhi includono la semplice manipolazione delle cellule giganti, l'alta percentuale di cellule che esprimono informazioni genetiche estranee, il semplice controllo dell'ambiente dell'ovocita mediante bagno di perfusione, e il controllo del potenziale di membrana .
L'inconveniente di questo sistema di espressione è la variazione stagionale osservato in molti laboratori 17-20. La ragione di questa variazioneè tutt'altro che chiaro. Inoltre, la qualità degli ovociti è spesso osservato variare fortemente. I metodi tradizionali 7-9 hanno incluso l'isolamento di lobi dell'ovaia, l'esposizione dei lobi ovariche di collagenasi per alcune ore, la selezione di ovociti denudati, e la microiniezione ovocita. Qui, una serie di alternative, procedure veloci sono riferito che ci hanno permesso di lavorare con questo sistema di espressione per più di 30 anni senza variazioni stagionali e piccole variazioni nella qualità degli ovociti.
I metodi modificati e migliorati qui descritte per l'isolamento di ovociti, microiniezione con cRNA, e la rimozione di strati di cellule follicolari possono essere usate per l'espressione di qualsiasi proteina di scelta nel oocita di Xenopus. Il metodo molto semplice per modifiche soluzione veloce del mezzo intorno l'ovocita può essere applicato allo studio di qualsiasi recettore ionotropico e dei vettori.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi descritti in questo articolo si discostano da quelli utilizzati tradizionalmente 7-9. È standard per esporre i lobi delle ovaie ad un 1 a 2 h trattamento collagenasi 8; isolare intatti, ovociti denudati; e li inietta con mRNA utilizzando dispositivi di iniezione commerciali. Questa procedura classica presenta i seguenti inconvenienti: 1) Gli oociti sono suscettibili di essere danneggiato dalla lunga esposizione ad alte concentrazioni di collagenasi. 2) Gli ovociti denudati instabili devon…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).
Materials
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/ml and 100 μg streptomycin/ml |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μl, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, gauge 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD X 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
Riferimenti
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