Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו
Summary
Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.
Abstract
הביצית Xenopus כמערכת ביטוי Heterologous עבור חלבונים, תוארה לראשונה על ידי ואח Gurdon. 1 ו כבר בשימוש נרחב מאז גילויו (הפניות 2 – 3, והפניות בו). מאפיין זה הופך את הביצית אטרקטיבית לביטוי ערוץ הזר הוא שפע העניים של תעלות יונים אנדוגני 4. מערכת ביטוי זה הוכיח עצמו שימושי לאפיון של חלבונים רבים, ביניהם תעלות יונים מגודרת ליגנד.
הביטוי של קולטנים של GABA ב ביציות Xenopus והאפיון הפונקציונלי שלהם מתואר כאן, כולל הבידוד של ביציות, microinjections עם קרנה, הסרת שכבות תאי זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו. הנהלים היו אופטימיזציה במעבדה זו 5,6 ו לסטות אלה בשימוש שגרתי 7-9. באופן מסורתי, ביציות ערומים ערוכותעם טיפול collagenase ממושך של אונות שחלה ב RT, וביציות הערומים האלה microinjected עם mRNA. באמצעות שיטות אופטימיזציה, חלבונים בממברנה מגוונים הובעו ולמד עם מערכת זו, כגון קולטנים של GABA רקומביננטי 10-12, תעלות כלוריד רקומביננטי אנושי 13, תעלות אשלגן Trypanosome 14, ו טרנספורטר מיו -inositol 15, 16.
השיטות המפורטות כאן ניתן להחיל את הביטוי של חלבון כלשהו של בחירה ב ביציות Xenopus, ושינוי הפתרון המהיר שניתן להשתמש בם כדי ללמוד תעלות יונים ליגנד מגודרת אחרות.
Introduction
ביציות Xenopus נמצאים בשימוש נרחב כמערכת ביטוי (הפניות 2 – 3, והפניות בו). הם מסוגלים להרכיב כראוי לשלב חלבוני multisubunit פעילים מבחינה תפקודית לתוך ממברנות הפלזמה שלהם. באמצעות מערכת זו, ניתן לחקור חלבונים בממברנה תפקודי לבד או בשילוב עם חלבונים אחרים, כדי ללמוד את המאפיינים של מוטציה, כימרי, או חלבונים בשרשור, ו להקרין תרופות פוטנציאליות.
יתרונות שימוש ביציות פני מערכות ביטוי Heterologous אחרות נמנו טיפול פשוט של התאים הענקים, השיעור הגבוה של תאי מבטאי מידע גנטי זר, השליטה הפשוטה של הסביבה של הביצית באמצעות זלוף אמבטיה, ואת השליטה על פוטנציאל הממברנה .
החיסרון של מערכת ביטוי זה הוא התנודתיות העונתית שנצפתה במעבדות רבות 17-20. הסיבה וריאציה זורחוק מלהיות ברור. בנוסף, איכות ביציות הוא נצפה לעיתים קרובות כדי להשתנות מאוד. שיטות מסורתיות 7-9 כללו את הבידוד של אונות שחלה, החשיפה של אונות שחלה כדי collagenase עבור כמה שעות, הבחירה של ביציות ערומות, ואת microinjection הביצית. כאן, מספר החלופי, הנהלים מהר מדווח כי אפשר לנו לעבוד עם מערכת ביטוי זה במשך יותר מ -30 שנה ללא וריאציה עונתיות וריאציה מעט באיכות ביצית.
השיטות לשנות ולשפר אותו מתואר כאן עבור הבידוד של ביציות, microinjection עם קרנה, והסרה של שכבות תאי זקיקים ניתן להשתמש על מנת לתת ביטוי לכל חלבון רצוי, לפי בחירה, ביצית Xenopus. השיטה פשוטה מאוד לשינויי פתרון מהירים של המדיום סביב הביצית ניתן להחיל המחקר של כל ערוץ יון מגודר ליגנד של נישאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות המתוארות במאמר זה לסטות אלה המשמשים באופן מסורתי 7-9. זהו תקן לחשוף את האונות של השחלה כדי טיפול collagenase 1 עד 2 h 8; לבודד ביציות ניזוק, חשופה; ולהזריק אותם עם ה- mRNA באמצעות התקני הזרקה מסחריים. הליך קלסי זו כולל את החסרונות הבאים: 1) ביציות צפויות להינזק על …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).
Materials
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/ml and 100 μg streptomycin/ml |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μl, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, gauge 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD X 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
Riferimenti
- Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).
- Soreq, H. The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes. CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).
- Sigel, E. Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins. J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).
- Dascal, N. The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels. CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).
- Sigel, E. Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid. J Physiol. 386, 73-90 (1987).
- Sigel, E., Minier, F. The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins. Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).
- Colman, A., Hames, B. D., Higgins, S. J. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. Transcription and Translation’A Practical Approach. , 49-69 (1984).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Defolliculation of Xenopus oocytes. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).
- Smart, T. G., Krishek, B. J., Boulton, A. A., Baker, ., Wolfgang, W. a. l. z. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. Patch-Clamp Applications and Protocols. , 259-305 (1995).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital. Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity. Sci Rep. 6, 25943 (2016).
- Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).
- Burgunder, J. M., et al. Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese. Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).
- Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes. FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei. J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth. Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).
- Wu, M., Gerhart, J. Raising Xenopus in the laboratory. Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).
- Gurdon, J. B., Wilt, F. H., Wessels, N. K. American clawed frogs. Methods in developmental biology. , 75-84 (1967).
- Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation. Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).
- Green, S. L. Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis). Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).
- Kressmann, A., Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. , 388-407 (1980).
- Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site. Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).
- Dumont, J. N., Brummett, A. R. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues. J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).
- Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3′,5′-cyclic monophosphate. J Physiol. 352, 551-574 (1984).
- Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides. Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).
- Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function. Neuron. 5, 703-711 (1990).
