Bu protokol, yetişkin ve yaşlı insanların iskelet kasından izole edilmesi ve miyoblast progenitör hücrelerin kültür sağlam tekrarlanabilir ve basit bir yöntem tarif eder. Burada kullanılan kaslar ayak ve bacak kaslarını içerir. Bu yaklaşım, fonksiyonel çalışmalar için birincil miyoblastların zenginleştirilmiş popülasyonun izolasyon sağlar.
İskelet kası homeostasis kas büyümesi (hipertrofisi), atrofi ve yenilenme bağlıdır. Yaşlanma sırasında ve çeşitli hastalıklarda, kas erimesi meydana gelir. kas kitlesi ve işlevi kaybı, kas lifi tipi atrofi, lif tipi anahtarlama, uydu hücreleri, kas kök hücreleri ve diğer patofizyolojik süreçlerin fonksiyon bozukluğu ile bağlantılı hatalı kas rejenerasyon ile ilişkilidir. Bu değişiklikler intrasellüler değişiklikler yanı sıra yerel ve sistemik nişler ile ilişkilidir. Kas yaşlanma en yaygın olarak kullanılan kemirgen modellerinde ek olarak, orada kas homeostazisini incelemek için bir ihtiyaçtır ve bağlı etik sonuçları açısından, ağırlıklı olarak, in vitro kültürleri oluşan insan modelleri kullanarak israf. İnsan miyojenik Progenitör Hücrelerinin (MPCs) ve Miyogenesis birincil miyoblastların geniş kullanılmasına rağmen, moleküler mekanizmalar yaşla ilişkili mus farklı yönlerini düzenleyen incelemek için insan primer myoblast ve mihotüp kültürleri kullanarak sınırlı veriler bulunmaktadırcle erimesi, kemirgen kas önerilen yaşlanma mekanizmaları doğrulama yardım. yetişkin ve yaşlı insanlardan izole insan MPCs, birincil iskelet hücreleri ve miyotüplerinden, kullanımı kas büyümesi, atrofi ve rejenerasyon ile ilişkili süreçlerin moleküler mekanizmaların fizyolojik ilgili bir model sağlar. enzimatik sindirim kullanılarak insan kas örneklerinden miyoblastların ve miyotüplerinden – Burada detaylı olarak izolasyon ve insan MPCs ve döl bakımı için, sağlam, ucuz, tekrarlanabilir ve verimli protokol açıklar. Ayrıca, yetişkin ve yaşlı insanların birincil miyoblastlar, bir in vitro kültür içinde yaşlanmaya uğrayabilir hangi kanal adedi belirledik. Son olarak, bu miyoblastları transferinde yeteneğini ve çoğalma ve farklılaşma kapasitesinin karakterize ve Miyogenesis ve kas in vitro israf moleküler mekanizmaların işlevsel çalışmalar gerçekleştirmek için uygunluğunun teklif yeteneğini gösterir. </p>
kırılganlık iskelet kas kitlesi ve fonksiyon sonuçlarının hastalıksız ve yaşa bağlı ilerleyici kaybı, yaşlı insanların yaşam kalitesini gücü ve azalma düşüş. İskelet kası yaklaşık% 40 vücut kütlesinin 1 oluşturmaktadır. Nedeniyle yağ ve fibroz infiltrasyonu, tek tek myofibers ve kas kalite azaltma ilerleyen kurumasının yaşlanma, hastalık sırasında, 1, 2, 3, 4, 5, 6 oluşur. Son zamanlarda, özellikle kemirgenlerde oluşan kas lifi kaybı, insanlarda 7 gerçekleşmeyebilir, iskelet kası yaşlanma türe özgü farklılıklar meydana geldiği önerilmiştir. Bununla birlikte, yaşlı memelilerin kalan kas lifleri hasar ve bozulmuş rejenerasyon artmış duyarlılık ile karakterizedir <supclass = "xref"> 8. Yetişkin kas tamir ve bakım uydu hücreleri 9, 10 aracılık eder. kas hasarı ve diğer ilgili ipuçları üzerine, uydu hücreleri aktive ve çoğalırlar olur. hücrelerin bir alt durgun durumuna geri döner ve geri kalan miyoblastlar (miyojenik Progenitör Hücrelerinin – MPCs) içine ilerler. Bunlar mevcut myofiber 11 onarmak için katkıda bulunur. Uydu hücrelerinin fonksiyonelliği, kas rejenerasyon başarı ve 12, 13, 14, 15 gösterilmiştir yaşlanma uydu hücre durumunu değişiklikleri tespit eder. Ayrıca, eski, insan ve kemirgen kas uydu hücreleri, bir transkripsiyon profil anahtar gösteren ve potansiyel rejeneratif azaltılmış 16, 17, </sup> 18, 19. Farelerin ve insanlardan elde edilen kas uydu hücreleri, aynı zamanda sınırlı işlevsellik 20 elde yaşlanmaya uğrayabilir gösterilmiştir.
Kas homeostazındaki çalışma sağlayan en köklü hücre hattı fare C2C12 hücre hattı 21'dir. Çalışmalarda önemli bir miktarı aynı zamanda murin primer miyoblastlar 22 kullandık. Bu kültürler, murin ve omurgalı Miyogenesis yanı sıra, kas rejenerasyonu miyotüp / myofiber atrofi ve kas hastalık sırasında oluşan ve 23, 24, 25, 26, yaşlanma hipertrofisi süreçlerinin önemli bir anlayışı yol açmıştır. Daha yakın zamanlarda, çeşitli gruplar Miyogenesis ve kas yaşlanmasını incelemek için insan primer miyoblastları kullanılarak tarif var. Ancak, regar ile fikir birliği eksikliği varYetişkin ve yaşlı insanlarda 27, 28, 29, 30, 31 kasından izole edilen primer miyoblastların arasındaki farklılıklara DS. Sistemik ve lokal çevre, yaşlanma ve hastalık 6, 32, 33, 34, gelişimi sırasında meydana gelen karakterize farklılıklara rağmen, in vitro myoblast ve mihotüp kültürleri kas gelişimi, büyümesi ve atrofi ile ilişkili moleküler mekanizmaları çalışmak için en erişilebilir araçları kalır. Buna ek olarak, bu çalışmalar sadece sağlam sağlar, ancak, aynı zamanda in vitro araç göreceli olarak hızlı, ucuz ve yüksek verimli. Ayrıca insan kas çalışmaları ile ilgili etik sonuçları bu gen ifadesinin manipülasyonları içeren fonksiyonel deneyler için ne anlama <em>, In vitro insan myoblast ve mihotüp kültürleri omurgalı model organizmaların mevcut tek alternatif kalır.
Burada, yetişkin ve yaşlı insanların kas birincil iskelet hücreleri veya MPCs dayanıklı, ucuz ve yeniden üretilebilir bir izolasyon için basit bir deney protokolü göstermektedir in vitro kültürü (Şekil 1) standart koşullar açıklanmıştır. kas primer kültürlerinde genellikle iskelet hücreleri yanında fibroblastları içerdiğinden, biz gelişmiş saflık ve birincil miyoblastların kalitesi amaçlayan bir preplating adım öneriyoruz. Özetlemek gerekirse, verimli ve tekrarlanabilir izolasyonu, kültür ve yetişkin ve yaşlı insanların iskelet kasından zenginleştirilmiş fonksiyonel MPCs / primer miyoblastların fonksiyonel çalışmalar için izin veren bir protokol kurduk.
Burada, ekstansör digitorium brevis, tibialis anterior veya abdüktör halluces kasları yetişkin ve yaşlı insanlarda kas progenitör hücre / birincil miyoblastları izole basit, sağlam, ucuz, tekrarlanabilir ve etkili yöntem mevcut. Bu protokol, FACS- veya MACS-sıralama olarak daha sofistike yöntemler, pratik mümkün ya da değil, özellikle de yetişkin ve yaşlı insanlardan insan birincil miyoblastları kullanarak çalışmalarını olanak sağlamayı amaçlamaktadır.
Bu yazıda sunulan izolasyon yöntemi, yaklaşık 2 saat sürer. kas izolasyonu sırasında kas kirlenmesini önlemek için% 70 etanol içinde yıkanmıştır. kas ayrışmasını enzimatik önce, küçük ama görünür parçalar halinde kas kesilmiş ve çok fazla kıyma haline gelme hücre hasarı önlemek için önemlidir. myofibers ayrışması ve uydu hücreleri ve kas kaynaklı öncü hücrelerin sürümünde sindirim sonuçları. iskelet kası ~ 20 mg, tek bir 60 mm yönelik halinde(20 cm 2) Petri kabı hücrelerini hasat için en uygun yüzey alanı oldu. Hücreler daha küçük bir yüzey hücre ölümü ve aglütinasyon artış gösterdi üzerine kaplandı ise daha büyük bir yüzeyi üzerine kaplanmış hücreler, azalmış bir çoğalma gösterdi.
izole üzerine, hücreler kültürlendi ve laminin kaplı plakalar üzerinde artmıştır. olmayan kaplı yüzeylerin kullanılmasını izolasyon başarısının azalma eğilimi. Bu nedenle, hücre tercihen, izole edildikten sonra, bir önceden kaplanmış bir yüzeye hasat edilebilir. hücreler, izolasyondan sonra olmayan bir kaplanmış yüzey üzerinde hasat halinde fibroblastlar ile zenginleştirilmiş kültürlerde miyoblastlar türetilmiş hücrelerden daha çok baskın olacak. Yanı sıra, laminin, bu tür Matrigel ve kollajen bazlı reaktifler olarak diğer hücre bağlanma çözeltilerinin kullanımı kullanılabilir. Kaplama çözeltileri hücre büyümesini teşvik, büyüme faktörleri ve diğer bileşikleri de içerebilir, ancak bu hücre davranışını ve bu nedenle deneysel sonuçlar değiştirebilir. İçindeherhangi bir büyüme faktörü veya diğer tamamlar yoksun olarak deneyim, 10 ug / ml laminin optimum konsantrasyonu ve uydu hücreleri ve miyoblast bağlanması ve çoğalması için uygun bir kaplama reaktifidir. Ayrıca, laminin doğrudan iskelet kas lifi ile uydu hücre eki ve göç önemli bir rol oynar sarcolemma, bağlantılı bazal lamina, doğal olarak bulunur.
kültür ortamı takviyeleri de birincil myoblast davranışı üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir. Bu tür FGFs veya IGF olarak örnek büyüme faktörü grupları için, FGF-2 mitojenik ve programlanmış hücre ölümü, cevabını 31 hem kontrol ile, birincil myoblast kültürlerinde çok yönlü etkileri vardır. Yetişkin ve yaşlı insanların kas izole primer miyoblastların davranış farklılıkları nedeniyle saflık o kadar olması çok muhtemeldir, çünkü özellikle titizlikle kültür koşullarını kontrol edilmesi gereklidirkültürler ve uzun vadeli kültürleri 35 sırasında kültüründe miyoblastları taşmasını fibroblastların olasılığı f. Bu fibroblastlar ile kültürlerin kirlenmesini azaltmak amacıyla olmayan bir kaplı yüzey üzerine ilk bölme boyunca hücrelerin 1 saatlik ön kaplama kullanılmıştır.
biz tarif yöntemi yetişkin ve yaşlı insanlarda hem de kasların miyojenik progenitör hücrelerin izole etmek için uygundur. Miyojenik hücre oranı yüksek gösterilen (Şekil 1 'de MF20 immün ile görünür MyoD ifade içi ve kas özellikleri ve 2) ve işlemlerin fonksiyonel çalışmalar için bir in vitro model olarak kullanılabilir, izole edilmiş hücre bir Örnek miyojenik topluluğundan oluşmaktadır kas homeostazı ile ilgili.
Daha önceki çalışmalar, insan primer miyoblastların izolasyonu ve özelliklerinin farklılıkları ya da bunun eksikliği, karakterize olanYetişkin ve yaşlı kişiler, 6, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 3 ila 6, 37, 38. Geriatrik ve / veya non-fonksiyonel insan MPCs varlığı, 22, 6 20 gösterilmiştir. Bununla birlikte, yeni izole edilmiş insan MPCs davranışında fark 27 gösterilmiştir. Bizim protokolü, yaşlı insanlar kasından izole edilen primer miyoblastların düşük çoğalma potansiyeli veya yaşlanma gibi en azından kısmen de olsa fenotipi muhafaza primer miyoblastların, izolasyonu sağlar ve bu kullanımına izin verir22 yaşlanma sırasında kas homeostazı moleküler mekanizmaların fonksiyonel çalışmalar için hücreleri.
Burada tarif edilen yöntem kullanılarak izole primer miyoblastlar miyojenik farklılaşma çalışmaları için değil, aynı zamanda bu tip yaşlanma sırasında insan miyojenik öncü hücrelerin meydana gelen gen ekspresyonunda değişikliklere gibi hücre içi değişiklikleri araştırmak için sadece kullanılabilir. Ancak, uzayan ex vivo kültür sırasında hücrelerde meydana gelen değişiklikler yaşlanma sırasında meydana gelen fenotipik ve genotipik değişiklikler analiz edilirken göz önünde bulundurulması gerekir. Biz bu amaçla taze izole edilmiş hücreleri kullanarak öneriyoruz.
Ayrıca, burada tarif edilen primer miyoblast kültür metodu sağlam in vitro fonksiyonel çalışmalar için izin genleşme ve insan primer miyoblastların nispeten uzun süreli kültür sağlar. Daha önce eden yöntemi kullanılarak izole miyojenik progenitör hücrelerin ekspresyon profili ve fu her ikisi için de kullanılabileceğini göstermiştirkas 22 yaşlanma ile ilişkili proseslerin nctional çalışmaları. Bu yöntem, aynı zamanda, yetişkin ve yaşlı kemirgenlerde kaslarına uygulanır ve yaşlanma ve fonksiyonel çalışmalar 22 içinde genetik ve epigenetik değişiklikler profil için kullanılabilir miyoblastların zenginleştirilmiş bir kültür izolasyonu sağlar. Bu yöntemin sınırları belli bir dereceye kadar kullanımı arasında, daha karmaşık, yayımlanmış yöntemler 6, 28, 29, 39, 40, 41, 42 kullanılarak elde edilebilir hücreleri yerine uydu hücreleri saf nüfusun karışık nüfusu 43.
Bu yetişkin ve yaşlı birincil miyoblastlar hücrelerin izolasyonu için, basitleştirilmiş, ekonomik ve yeniden üretilebilir bir protokol mevcutinsanlar. Bizim tecrübelerimize göre, (uydu hücreler-sınıflandırılmaktadır FACS gibi MACS- veya gibi) izolasyon ve insan primer miyoblastların kültürünün mevcut, daha sofistike yöntemler, hücrelerde transkriptomik veya proteomik değişiklikler profil olarak çalışmaların bazı türleri için idealdir. Bununla birlikte, bu yöntemler, pahalı uzman en azından bir düzeyde gerekir ve bağlı olarak saf birincil miyoblast kültürleri ve miyoblastlar overgrowing fibroblastlar düşük çoğalma oranı zor olabilir.
Biz fonksiyonel çalışmalarda kullanılmak üzere insan birincil miyoblastların basit izolasyonuna ve kültürünü izin veren bir tekrarlanabilir bir protokol mevcut. Buna ek olarak, laminin 42 kullanımı ve başarılı bir kültür 44 anahtar faktörler olarak bFGF sınırlı gerektiği sonucuna varılmıştır. Biz de hücreleri bölme ve ilk geçiş 45 az bir ön kaplama adım ne zaman santrifüj tarafından üretilen stres kaçınarak öneriyoruz. Elimizdeki, Özetlemek gerekirseizolasyon ve ayrıca kemirgenler kaslara geçerlidir ve ifade ve kas homeostasis işlevsel çalışmalar sağlayan yetişkin ve yaşlı insanların kas birincil miyoblastlar / MPCs kültürü için verimli bir protokol optimize edilmiş.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/L021668/1), the MRC and Arthritis Research UK as part of the MRC – Arthritis Research UK Centre for Integrated Research into Musculoskeletal Ageing (CIMA) and the Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (097826/Z/11/A). The authors would like to thank Dr Dada Pisconti (University of Liverpool) for her expertise and advice in the isolation of muscle progenitor cells.
60mm Petri dishes | Greiner Bio One | 628160 | Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS. |
Cell culture plates (6 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3516 | Corning Costar cell culture plates. 6 well, flat bottom (Individually wrapped) . |
Cell culture plates (12 wells) | Greiner bio-one | 657 160 | Cellstar Cell culture Multiwell Plates. |
Culture flasks | Greiner Bio One | 690175 (25cm2); 658175 (75cm2). | Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks. |
Standard Disposable Scalpel | Granton | 91310 | Sterile stainless steel blade, pattern: 10. |
Pipettes | Greiner bio-one | 606 180 (5 ml); 607 180 (10 ml); 760 180 (25 ml) | Cellstar Serological Pipettes. |
Pasteur plastic pipettes | Starlab | E1414-0311 | 3.0ml Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped. |
Syringe | BD | 300613 | 20 mL BD eccentric tip syringe. |
0.2 µm filters | Gilson | ALG422A | Sterile Syringe Filters CA 0.2um 33mm Pk50. |
Cell strainers | Fisher Scientific | 11597522 | Cell culture strainer sterile individually packed 70µm polypropylene. |
Collagenase D | Roche | 11088882001 | Collagenase D; ctivity: >0.15 U/mg |
Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: ≥0.5 units/mg solid. |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | Calcium chloride, anhydrous, beads, −10 mesh, ≥99.9% trace metals basis |
Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1mg/mL. |
DMEM-high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose. With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate. |
F-12 media | Gibco | 21765029 | Ham's F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine. |
FGF-b | PetroTech | 100-18B | Recombinant Human Fibroblast Growth Factor-basic. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Fetal Bovine Serum. |
Horse serum (HS) | Sigma-Aldrich | H1270 | Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered. |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered. |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered. |
TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red. |
DPBS (cell culture) | Sigma-Aldrich | D8537 | Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride. |
PBS (immunostaining) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Phosphate buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4). |
Methanol | Fisher | M/4000/PC17 | Methanol Analytical Reagent Grade |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 for molecular biology. |
anti-MF 20 antibody | DSHB | MF20-c 2ea 211 µg/ml. | MYH1E (MF 20) Mouse mAb. |
anti-MyoD antibody | Cell Signaling Technology | 13812P | MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb. |
anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | Rabbit mAb to Ki67 [SP6]. |
Anti-mouse 488 secondary antibody | Invitrogen | A-11029 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
Anti-rabbit 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
DAPI | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) |
Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | Senescence β-Galactosidase Staining kit. |
DMSO | Sigma-Aldrich | 41639 | Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC). |
Acridine Orange | Sigma-Aldrich | A8097 | Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O. |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O. |
Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Lipofectamine 2000 Transfection Reagent |
Scramble control for transfections | Qiagen | 1027271 | miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol) |
Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay | Qiagen | 218300 | Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor | Qiagen | 219300 | Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
Megafuge 2.0 R Centrifuge | Heraeus | 75003085 | n/a |
Centrifuge rotor | Heraeus | 3360 | Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm. |
Eclipse Ti-E Inverted Microscope System | Nikon | n/a | Eyepieces: CFI 10x/22; Total magnification: 100x (MF20, Live/dead and Ki67). |
Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10x/25; Total magnification: 100x (Senescence β-Galactosidase Staining). |
Axiovert 25 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: E-PL 10x/20. Total magnification: 100x (bright field). |
Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope | Nikon | n/a | Eyepiece: CFWN 10x/20. Total magnification: 100x (bright field). |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | Hydromount |