Metode for Studiet af horisontal genoverførsel i<em> Staphylococcus aureus</em
Summary
Vi beskriver her tre forskellige protokoller for in vitro undersøgelse af konjugation, transduktion, og naturlig transformation i Staphylococcus aureus.
Abstract
Et vigtigt træk ved den større opportunistisk humant patogen Staphylococcus aureus er sin ekstraordinære evne til hurtigt udvikler resistens over for antibiotika. Genomiske undersøgelser viser, at S. aureus bærer mange virulens og resistensgener beliggende i mobile genetiske elementer, hvilket antyder, at horisontal genoverførsel (HGT) spiller en kritisk rolle i S. aureus evolution. Men en fuld og detaljeret beskrivelse af metoden til at studere HGT i S. aureus stadig mangler, især med hensyn til naturlig transformation, som for nylig er blevet rapporteret i denne bakterie. Dette arbejde beskriver tre protokoller, som er nyttige til in vitro undersøgelse af HGT i S. aureus konjugation, phag transduktion, og naturlig transformation. Til dette formål, det cfr genet (chloramphenicol / florfenicol modstand), som giver de phenicoler, Lincosamider, Oxazolidinoner, pleuromutiliner, og streptogramin A (PhLOPSA) -resistance fænotype, blev anvendt. Forståelse af de mekanismer, hvorigennem S. aureus overfører genetisk materiale til andre stammer er afgørende for at forstå den hurtige overtagelse af resistens og hjælper med at afklare former for formidling rapporteret i overvågningsprogrammer eller yderligere forudsige spredningen tilstand i fremtiden.
Introduction
Staphylococcus aureus er en kommensal grampositiv bakterie, der naturligt bebor huden og næsehulen af mennesker og dyr. Denne bakterielle arter er den førende årsag til nosokomielle infektioner på hospitaler og sundhedsmiljøerne. Desuden har evnen til at udvikle resistens over for forskellige antimikrobielle forbindelser gjort forvaltningen af infektioner forårsaget af denne bakterie til en global bekymring.
To vigtige veje er involveret i spredningen af resistens fænotyper er kendt: den klonale udbredelse af resistente genotyper og udbredelsen af genetiske determinanter blandt den bakterielle pool. I tilfælde af S. aureus, forskellige antibiotiske resistensgener (samt virulensdeterminanter) har vist sig at være forbundet med mobile genetiske elementer (MGEs) 1. Tilstedeværelsen af disse elementer i genomet af S. aureus viser, at erhvervelse og overdragelse af genietisk materiale inden den bakterielle population kunne spille en vigtig rolle for S. aureus tilpasning og evolution.
Genetisk materiale kan udveksles gennem tre kendte mekanismer HGT i Gram-positive bakterier: transformation, konjugation og fag transduktion. Transformation indebærer optagelse af frit DNA. At erhverve fremmed DNA, bakterieceller nødt til at udvikle en særlig fysiologisk fase: kompetence scenen. Når denne fase nås, kompetente celler er i stand til at transportere DNA ind i cytoplasmaet, erhverve nye genetiske determinanter. I tilfælde af S. aureus, har eksistensen af naturlig transformation nylig blevet demonstreret 2. I tråd med dette har vores gruppe belyse relevansen af ekspressionen af suk faktor (en kryptisk sekundær transskription sigma faktor) i kompetence udviklingstrin og på hvordan dens konstitutiv ekspression gør S. aureus i stand til reaching kompetence scenen, som giver mulighed for erhvervelse af resistente fænotyper ved naturlig transformation 2.
Konjugation er en proces, der involverer overførsel af DNA fra en levende celle (donor) til en anden (recipient). Begge celler skal være i direkte kontakt, således at DNA, der skal udveksles samtidig være beskyttet af særlige strukturer, såsom rør eller porer. Overførsel af DNA ved denne fremgangsmåde kræver konjugative maskiner. I S. aureus, prototypen konjugative plasmid er PGO1, der huser den konjugative operon Traa 3.
Phag transduktion indebærer overførsel af DNA fra celle til celle gennem bakteriofaginfektion og indebærer pakning af bakterie-DNA, i stedet for virus-DNA, ind i fag-capsidet. De fleste af S. aureus isolater lysogeniseret af bakteriofager 1. Ved stressbetingelser, kan profager udskæres fra det bakterielle genome og skift til den lytiske cyklus.
Det er de tre velkendte mekanismer til DNA transmission i S. aureus. Der er nogle ekstra transfer mekanismer, såsom "pseudo-transformation" 2 og fag-lignende systemer i overførslen af sygdomsfremkaldende evne øer 4. For nylig, en gruppe rapporterede, at "nanorør" er involveret i overførslen af cellulære materialer (herunder plasmid-DNA) mellem naboceller 5, 6, men en opfølgende undersøgelse ikke er mødt fra andre grupper hidtil.
Dette arbejde giver den nødvendige metodik til at studere HGT i S. aureus ved at behandle de tre vigtigste transfer veje konjugation, transduktion, og naturlig transformation. De opnåede med disse metoder resultater blev anvendt til at undersøge transmissionen af den cfr gen (chloramphenicol / florfenicol modstand) blandtS. aureus-stammerne 7. Disse tre teknikker er alsidige værktøjer til undersøgelse af MGE transmission i S. aureus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette arbejde beskriver de tre store metoder til at studere HGT af genetiske determinanter i S. aureus. Selvom transduktion og konjugation er blevet studeret i årtier, blev eksistensen af naturlige transformation først for nylig anerkendt 2. Således er S. aureus udstyret med alle de tre store former for HGT, og teste dem alle er forpligtet til at klarlægge de mulige formidling veje for genetiske determinanter. Målet med dette arbejde er at udarbejde komplette protokol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly supported by Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution and JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).
Materials
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Becton Dickinson | 211825 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | 211059 | |
| Nutrient Broth No. 2 | Oxoid | CM0067 | |
| Sheep blood agar | Eiken Chemical Co.,Ltd. | E-MR96 | Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. |
| Agar powder | Wako Pure Chemical Industries | 010-08725 | |
| Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) | Wako Pure Chemical Industries | 191-01785 | |
| Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter | Merck Milipore | HAWG 02500 | |
| QIAfilter Plasmid Midi kit | QIAGEN | 12243 |
References
- Lindsay, J. A. Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus. IJMM. 300, 98-103 (2010).
- Morikawa, K., et al. Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).
- Caryl, J. A., O’Neill, A. J. Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci. Plasmid. 62, 35-38 (2009).
- Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).
- Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell. 144, 590-600 (2011).
- Dubey, G. P., et al. Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes. Dev cell. 36, 453-461 (2016).
- Cafini, F., et al. Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance. J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).
- Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures. Lancet. 1, 835-838 (1966).
- Kuroda, M., et al. Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 357, 1225-1240 (2001).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322, 1843-1845 (2008).
- Clinical Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically – Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. , (2006).
- Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction. BioTechniques. 26, 892-894 (1999).
- Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus. J. Antibiot. , (2015).
- Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).
- Ando, T., et al. Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer. Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).
- Evans, B. A., Rozen, D. E. Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae. ISME J. 7, 791-799 (2013).
- Wilson, D. L., et al. Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture. Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).
- McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated. Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).
- Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer. IJMM. 304, 103-109 (2014).
- Uchiyama, J., et al. Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage. ISME J. 8, 1949-1952 (2014).
