Summary

Metodologia para o Estudo da transferência horizontal de genes em<em> Staphylococcus aureus</em

Published: March 10, 2017
doi:

Summary

Descrevemos aqui três protocolos diferentes para a investigação in vitro de conjugação, transdução, transformação e natural em Staphylococcus aureus.

Abstract

Uma característica importante do grande agente patogénico humano oportunista Staphylococcus aureus é a sua capacidade extraordinária para adquirir rapidamente resistência a antibióticos. Estudos genómicos revelam que o S. aureus transporta muitos genes de virulência e resistência localizadas em elementos genéticos celulares, sugerindo que a transferência genética horizontal (HGT) desempenha um papel crítico na evolução S. aureus. No entanto, uma descrição completa e detalhada da metodologia utilizada para estudar HGT em S. aureus ainda está em falta, especialmente em relação transformação natural, que foi recentemente relatada nesta bactéria. Este trabalho descreve três protocolos que são úteis para a investigação in vitro de HGT em S. aureus conjugação, a transdução do fago, e transformação natural. Para este objectivo, o gene cfr (cloranfenicol / resistência florfenicol), que confere as fenicóis, Lincosamidas, Oxazolidinonas, pleuromutilinas, e estreptogramina A (PhLOPSA) -resistência fenótipo, foi usado. Compreender os mecanismos através dos quais S. aureus transfere material genético para outras estirpes é essencial para compreender a rápida aquisição de resistência e ajuda a esclarecer os modos de difusão relatados em programas de vigilância ou de prever ainda mais o modo de propagação no futuro.

Introduction

Staphylococcus aureus é uma bactéria Gram-positiva comensais que habita naturalmente na pele e cavidade nasal do ser humano e animais. Esta espécie bacteriana é a principal causa de infecções nosocomiais em hospitais e estabelecimentos de cuidados. Além disso, a sua capacidade de desenvolver resistência a diferentes compostos antimicrobianos fez a gestão das infecções causadas por esta bactéria em uma preocupação mundial.

Duas principais vias envolvidas na divulgação de fenótipos de resistência são conhecidos: a disseminação clonal de genótipos resistentes e de difusão dos determinantes genéticos entre a piscina bacteriana. No caso de S. aureus, diferentes genes de resistência a antibióticos (bem como determinantes de virulência) foram encontrados para ser associado com elementos genéticos móveis (EGM) 1. A presença destes elementos no genoma de S. aureus indica que a aquisição e a transferência de genmaterial de etic dentro da população bacteriana poderia desempenhar um papel importante para a adaptação de S. aureus e evolução.

O material genético pode ser trocada através de três mecanismos bem conhecidos de HGT em bactérias Gram-positivas: transformação, conjugação e transdução do fago. Transformação envolve a absorção de DNA livre. Para adquirir DNA estranho, as células bacterianas precisam desenvolver uma fase fisiológicas especiais: a fase de competência. Quando este estado for atingido, as células competentes são capazes de transportar o DNA para o citoplasma, a aquisição de novos determinantes genéticos. No caso de S. aureus, a existência de transformação natural foi recentemente demonstrado 2. Em consonância com isso, o nosso grupo tem lançar luz sobre a relevância da expressão do fator de suspiro (um fator sigma de transcrição secundária enigmática) na fase de competência do desenvolvimento e sobre a forma como a sua expressão constitutiva torna S. aureus capaz de reaching o estágio de competência, o que permite a aquisição de fenótipos resistentes pela transformação natural 2.

A conjugação é um processo que envolve a transmissão de ADN a partir de uma célula viva (dador) para um outro (receptor). Ambas as células devem estar em contacto directo, permitindo que o ADN a ser trocados enquanto está a ser protegida por estruturas especiais, tais como tubos ou poros. A transferência de ADN por este método requer a maquinaria conjugativo. Em S. aureus, o plasmídeo protótipo conjugada é PGO1, que abriga o operon TRAA conjugada 3.

O fago de transdução envolve a transferência de DNA a partir de uma célula para outra por meio da infecção de bacteriófago e implica a embalagem de ADN bacteriana, em vez do ADN virai, na cápside do fago. A maioria dos isolados de S. aureus são lysogenized por bacteriófagos 1. Após a condições de stress, profagos pode ser excisado do genom bacterianae e mudança para o ciclo lítico.

Estes são os três mecanismos bem conhecidos para a transmissão do ADN em S. aureus. Existem alguns mecanismos de transferência adicionais, tais como "pseudo-transformação" e dois sistemas de fagos como na transferência de ilhas de patogenicidade 4. Recentemente, um grupo relatou que "nanotubos" estão envolvidos na transferência de materiais celulares (incluindo ADN de plasmídeo) entre células vizinhas 5, 6, mas um estudo de seguimento não apareceu a partir de outros grupos de medida.

Este trabalho apresenta a metodologia necessária para estudar HGT em S. aureus, abordando as três principais vias de transferência de conjugação, a transdução e transformação natural. Os resultados obtidos com estas metodologias foram usadas para estudar a transmissão do gene CFR (cloranfenicol / resistência florfenicol) entreS. aureus 7. Estas três técnicas são ferramentas versáteis para a investigação de transmissão MGE em S. aureus.

Protocol

NOTA: As estirpes e os materiais utilizados neste trabalho estão listados na Tabela 1 e a Tabela de Materiais, respectivamente. Nos experimentos de transmissão, N315 e COL cfr derivados -positivas foram usados como doadores do gene cfr (N315-45 e COL-45). Estas estirpes foram anteriormente obtidos por conjugação, utilizando como doador de um CFR clínica -positivo estirpe de Staphylococcus epidermidis (ST2), seguindo o protocolo padrão de conjuga…

Representative Results

Os resultados aqui representadas foram previamente publicados (adaptado da referência 7 com a permissão do editor). Foram estudados os potenciais vias de transmissão do gene CFR, o que faz com baixo nível de resistência de linezolida e a expressão do fenótipo de resistência PhLOPSA-14, 15 em estirpes de S. aureus, investigando três mecanismos de HGT. <p class="jove_content" f…

Discussion

Este trabalho descreve os três métodos principais para estudar a HGT de determinantes genéticos em S. aureus. Apesar de transdução e conjugação têm sido estudados há décadas, a existência de transformação natural só recentemente foi reconhecida 2. Assim, S. aureus é equipado com todos os três principais modos de HGT, e testar todos eles é necessária para esclarecer as possíveis vias de disseminação de determinantes genéticos. O objetivo deste trabalho…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was partly supported by Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution and JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).

Materials

Tryptic Soy Broth (TSB)  Becton Dickinson  211825
Brain Heart Infusion (BHI) Becton Dickinson  211059
Nutrient Broth No. 2 Oxoid CM0067
Sheep blood agar Eiken Chemical Co.,Ltd. E-MR96 Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. 
Agar powder Wako Pure Chemical Industries 010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) Wako Pure Chemical Industries 191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter Merck Milipore HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit QIAGEN 12243

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Cite This Article
Cafini, F., Thi Le Thuy, N., Román, F., Prieto, J., Dubrac, S., Msadek, T., Morikawa, K. Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55087, doi:10.3791/55087 (2017).

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