Summary

الانضباطي الهلاميات المائية من الرئوي خارج الخلية مصفوفة للثقافة خلية 3D

Published: January 17, 2017
doi:

Summary

هذا هو الأسلوب لإنشاء سقالة زراعة الخلايا 3-الأبعاد من المصفوفة خارج الخلية الرئوية. تتم معالجة الرئة سليمة إلى الهلاميات المائية التي يمكن أن تدعم نمو الخلايا في ثلاثة أبعاد.

Abstract

نحن هنا نقدم وسيلة لإنشاء متعددة عنصر الهلاميات المائية زراعة الخلايا في المختبر لزراعة الخلايا في الرئة. بدءا صحية أون أنسجة الرئة كتلة من الخنازير، الفئران، أو الماوس، يتم perfused الأنسجة والمغمورة في المنظفات الكيميائية اللاحقة لإزالة الحطام الخلوي. مقارنة نسيجية للأنسجة قبل وبعد المعالجة تؤكد إزالة أكثر من 95٪ من المزدوج تقطعت بهم السبل تلطيخ الحمض النووي وألفا غالاكتوزيداز تشير تتم إزالة معظم الحطام الخلوي. بعد decellularization، والنسيج هو مجفف بالتجميد ثم cryomilled إلى مسحوق. يتم هضم مسحوق مصفوفة لمدة 48 ساعة في محلول الببسين الهضم الحمضي ثم تحييد لتشكيل حل بريجل. دبق من الحل بريجل يمكن أن يتسبب من قبل الحضانة عند 37 درجة مئوية، ويمكن استخدامها تحييد التالية مباشرة أو تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. الطلاء يمكن تشكيلها باستخدام حل بريجل على طبق من ذهب غير المعالجة لجالذراع المرفق. الخلايا يمكن تعليقها في بريجل قبل التجميع الذاتي لتحقيق ثقافة 3D، مطلي على سطح هلام تشكلت من الخلايا التي يمكن أن تهاجر من خلال منصة الاعدام، أو مطلية على الطلاء. قدمت تعديلات على استراتيجية يمكن أن تؤثر درجة الحرارة دبق، والقوة، أو أحجام جزء من البروتين. ما وراء تشكيل هيدروجيل، يمكن زيادة صلابة هيدروجيل باستخدام genipin.

Introduction

Translating in vitro results to the clinic is one of the most challenging issues facing biomedical researchers. In vitro research on tissue culture plastic is easier, more convenient, and maintains high cell viability.1 This approach is a reasonable starting point, but the results have limited clinical translation. Increasingly, laboratories are incorporating three-dimensional constructs to replace the traditional two-dimensional methods. Reviews are available for many three-dimensional environments, from biological scaffolds to polymeric scaffolds.2,3

Biological frameworks can mimic characteristics of in vivo environments as they contain many of the protein and glycosaminoglycan components of the native matrix and provide familiar binding sites for cells to attach to and recognize. Extracellular matrix (ECM) derived materials have been shown to be capable scaffolds for cell attachment and proliferation.4 One challenge that limits the application of ECM hydrogel platforms stems from their inherently weak mechanical properties following gelation. Native tissue often has mechanical properties that are magnitudes higher than hydrogels. Non-toxic crosslinking agents can increase the mechanical properties of hydrogels to better mimic the native tissue environment. Genipin is a non-toxic, natural crosslinker derived from Gardenia plants with the ability to closely tailor mechanical properties of ECM with changes in genipin concentration5,6.

Nearly all cells in the body exist in, and organize on, ECM that they either produce or maintain. New focus on the universal importance of ECM in the organization, condition, and function in every organ or system has sparked the production of matrix based platforms for in vitro investigation. Porcine small intestine submucosa is the most extensively studied naturally-derived scaffold, and it has been used to regenerate tendons, ligaments, skeletal muscle4, and even bone7. Matrices from other organs and donor species have also demonstrated good tissue regeneration potential. The use of foreign ECM components causes minimal issues with immunomodulation. After elimination of host cellular matter, the remaining ECM will be similar in amino acid content and organization to all other mammalian species8. There is a growing line of thinking that the best way to examine cell-ECM interactions in vitro is to utilize organ-specific ECM scaffolds. Each organ provides a unique composition of proteins and proteoglycans to create cellular niches. Niches provide structural, functional and even the enzymatic breakdown of the extracellular matrix contributing to biophysical signaling. To attain an in vitro microenvironment most similar to the in vivo microenvironment, use of tissue specific ECM would optimize the cellular niches for research.

The goal of this protocol is to provide a method for establishing a hydrogel scaffold unique to the lung ECM. This method provides a platform for in vitro research on lung cell-ECM interactions.

Protocol

حل تصفية العقيمة الاتجاهات DIH 2 O نعم فعلا DIH 2 O؛ العقيمة التي تمت تصفيتها 0.1٪ تريتون X-100 الحل نعم فعلا تحت غطاء الدخان إضافة 100 ميكر?…

Representative Results

باستخدام هذه الطريقة، لدينا انتاج الهلاميات المائية من الخنزير العادي، الفئران، والرئتين الماوس (الشكل 1). توفر الرئتين معالجة ما يقدر ب 5 ملغ، 40 ملغ، و 10 غراما من مسحوق ECM على التوالي. ويظهر لمحة عامة عن عملية في الشكل 2. تصورات رئيس?…

Discussion

واحد من جوانب أساسية في علم الأحياء هو التنظيم الذاتي للجزيئات في الهياكل الهرمية أن تنفيذ مهمة معينة. 13 في المختبر، يعتمد التجميع الذاتي على العديد من العوامل مثل تركيز الملح، ودرجة الحموضة، ومدة الهضم. كما هو مبين، والتنظيم الذاتي أشكال هيدروجيل عندما تعود ا…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونود أن نشكر مزارع سميثفيلد للتبرع أنسجة الرئة الخنازير سليمة. كما نود أن نشكر الدكتور هو جين يانغ، الدكتورة كرستينا تانغ وقسم الجراحة جامعة فرجينيا كومنولث البلاستيك على إتاحة الفرصة لنا لاستخدام معداتها. أعدت هيدروجيل والأنسجة عينات للوزارة شؤون المرأة في وزارة جامعة فرجينيا كومنولث التشريح ومرفق بيولوجيا الأعصاب الميكروسكوب المعتمدة، في جزء منه، بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة NINDS مركز كور غرانت 5 P30 NS047463، وجزئيا، من خلال شكل تمويل المعاهد الوطنية للصحة NCI السرطان مركز دعم جرانت P30 CA016059. SEM التصوير العينات في جامعة فرجينيا كومنولث في تقنية النانو مرفق الأساسية توصيف (NCC). وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية، CMMI 1351162.

Materials

Triton X-100  Fisher Scientific BP151-100 Use in fume hood with eye protection and gloves.
Sodium Deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-100g Use with eye protection and gloves.
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506-500g None
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016-500g None
DNase Sigma-Aldrich D5025-150KU None
HCl Sigma-Aldrich 258148-500ML Use with eye protection and gloves.
Pepsin Sigma-Aldrich P6887-5G Use in fume hood with eye protection and gloves.
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500 Use with eye protection and gloves.
Genipin Wako Chemicals 078-03021 Use in fume hood with eye protection and gloves.
PBS 10x Quality Biological 119-069-151 None
PBS VWR 45000-448 None
Filter Paper Whatman 8519 N/A
Hand pump Fisher Scientific 10-239-1 N/A
Graduate Beaker VitLab 445941 N/A
Cryomill SPEX 6700 Use cryogloves and eye protection.
Lyophilizer FTS FlexiDry Use gloves.
Rheometer Discovery HR-2 Use gloves and eye protection.

Riferimenti

  1. Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. . Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. 14, (2008).
  2. Haycock, J. W. . 3D Cell Culture. , (2011).
  3. Walker, J. M., Ed, . Epithelial cell culture protocols. , (2012).
  4. Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).
  5. Koo, H. -. J., Lim, K. -. H., Jung, H. -. J., Park, E. -. H. Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin. J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).
  6. Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
  7. Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa. J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).
  8. Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).
  9. Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. J.Biomed.Mater.Res.A. , (2016).
  10. Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
  11. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
  12. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS One. 5 (9), e12905 (2010).
  13. Ratner, B. D., Bryant, S. J. Biomaterials: where we have been and where we are going. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).
  14. Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).
  15. Zhang, W. -. J., et al. The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro. J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).
  16. Booth, A. J., et al. Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).
  17. Matsuda, A., et al. Evidence for human lung stem cells. N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).
  18. Zuo, W., et al. p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).
  19. Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
  20. Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).
check_url/it/55094?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (119), e55094, doi:10.3791/55094 (2017).

View Video