هذا هو الأسلوب لإنشاء سقالة زراعة الخلايا 3-الأبعاد من المصفوفة خارج الخلية الرئوية. تتم معالجة الرئة سليمة إلى الهلاميات المائية التي يمكن أن تدعم نمو الخلايا في ثلاثة أبعاد.
نحن هنا نقدم وسيلة لإنشاء متعددة عنصر الهلاميات المائية زراعة الخلايا في المختبر لزراعة الخلايا في الرئة. بدءا صحية أون أنسجة الرئة كتلة من الخنازير، الفئران، أو الماوس، يتم perfused الأنسجة والمغمورة في المنظفات الكيميائية اللاحقة لإزالة الحطام الخلوي. مقارنة نسيجية للأنسجة قبل وبعد المعالجة تؤكد إزالة أكثر من 95٪ من المزدوج تقطعت بهم السبل تلطيخ الحمض النووي وألفا غالاكتوزيداز تشير تتم إزالة معظم الحطام الخلوي. بعد decellularization، والنسيج هو مجفف بالتجميد ثم cryomilled إلى مسحوق. يتم هضم مسحوق مصفوفة لمدة 48 ساعة في محلول الببسين الهضم الحمضي ثم تحييد لتشكيل حل بريجل. دبق من الحل بريجل يمكن أن يتسبب من قبل الحضانة عند 37 درجة مئوية، ويمكن استخدامها تحييد التالية مباشرة أو تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. الطلاء يمكن تشكيلها باستخدام حل بريجل على طبق من ذهب غير المعالجة لجالذراع المرفق. الخلايا يمكن تعليقها في بريجل قبل التجميع الذاتي لتحقيق ثقافة 3D، مطلي على سطح هلام تشكلت من الخلايا التي يمكن أن تهاجر من خلال منصة الاعدام، أو مطلية على الطلاء. قدمت تعديلات على استراتيجية يمكن أن تؤثر درجة الحرارة دبق، والقوة، أو أحجام جزء من البروتين. ما وراء تشكيل هيدروجيل، يمكن زيادة صلابة هيدروجيل باستخدام genipin.
Translating in vitro results to the clinic is one of the most challenging issues facing biomedical researchers. In vitro research on tissue culture plastic is easier, more convenient, and maintains high cell viability.1 This approach is a reasonable starting point, but the results have limited clinical translation. Increasingly, laboratories are incorporating three-dimensional constructs to replace the traditional two-dimensional methods. Reviews are available for many three-dimensional environments, from biological scaffolds to polymeric scaffolds.2,3
Biological frameworks can mimic characteristics of in vivo environments as they contain many of the protein and glycosaminoglycan components of the native matrix and provide familiar binding sites for cells to attach to and recognize. Extracellular matrix (ECM) derived materials have been shown to be capable scaffolds for cell attachment and proliferation.4 One challenge that limits the application of ECM hydrogel platforms stems from their inherently weak mechanical properties following gelation. Native tissue often has mechanical properties that are magnitudes higher than hydrogels. Non-toxic crosslinking agents can increase the mechanical properties of hydrogels to better mimic the native tissue environment. Genipin is a non-toxic, natural crosslinker derived from Gardenia plants with the ability to closely tailor mechanical properties of ECM with changes in genipin concentration5,6.
Nearly all cells in the body exist in, and organize on, ECM that they either produce or maintain. New focus on the universal importance of ECM in the organization, condition, and function in every organ or system has sparked the production of matrix based platforms for in vitro investigation. Porcine small intestine submucosa is the most extensively studied naturally-derived scaffold, and it has been used to regenerate tendons, ligaments, skeletal muscle4, and even bone7. Matrices from other organs and donor species have also demonstrated good tissue regeneration potential. The use of foreign ECM components causes minimal issues with immunomodulation. After elimination of host cellular matter, the remaining ECM will be similar in amino acid content and organization to all other mammalian species8. There is a growing line of thinking that the best way to examine cell-ECM interactions in vitro is to utilize organ-specific ECM scaffolds. Each organ provides a unique composition of proteins and proteoglycans to create cellular niches. Niches provide structural, functional and even the enzymatic breakdown of the extracellular matrix contributing to biophysical signaling. To attain an in vitro microenvironment most similar to the in vivo microenvironment, use of tissue specific ECM would optimize the cellular niches for research.
The goal of this protocol is to provide a method for establishing a hydrogel scaffold unique to the lung ECM. This method provides a platform for in vitro research on lung cell-ECM interactions.
واحد من جوانب أساسية في علم الأحياء هو التنظيم الذاتي للجزيئات في الهياكل الهرمية أن تنفيذ مهمة معينة. 13 في المختبر، يعتمد التجميع الذاتي على العديد من العوامل مثل تركيز الملح، ودرجة الحموضة، ومدة الهضم. كما هو مبين، والتنظيم الذاتي أشكال هيدروجيل عندما تعود ا…
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نشكر مزارع سميثفيلد للتبرع أنسجة الرئة الخنازير سليمة. كما نود أن نشكر الدكتور هو جين يانغ، الدكتورة كرستينا تانغ وقسم الجراحة جامعة فرجينيا كومنولث البلاستيك على إتاحة الفرصة لنا لاستخدام معداتها. أعدت هيدروجيل والأنسجة عينات للوزارة شؤون المرأة في وزارة جامعة فرجينيا كومنولث التشريح ومرفق بيولوجيا الأعصاب الميكروسكوب المعتمدة، في جزء منه، بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة NINDS مركز كور غرانت 5 P30 NS047463، وجزئيا، من خلال شكل تمويل المعاهد الوطنية للصحة NCI السرطان مركز دعم جرانت P30 CA016059. SEM التصوير العينات في جامعة فرجينيا كومنولث في تقنية النانو مرفق الأساسية توصيف (NCC). وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية، CMMI 1351162.
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use with eye protection and gloves. |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
PBS | VWR | 45000-448 | None |
Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |