マイクロ Rna と受ける DNA の組換えをクラス スイッチしてプラズマ細胞の分化誘導された B 細胞における Mrna のゲノム解析の HDAC 阻害剤を介した変調
Summary
後成の要因は遺伝子発現を調節して B 細胞の機能を調節する遺伝的プログラムと対話できます。体外B 細胞刺激、qRT PCR とハイスループット マイクロ Rna シーケンスおよび mRNA シーケンスのアプローチを組み合わせて、B 細胞のマイクロ Rna と遺伝子発現のエピジェネティックな変調を分析できます。
Abstract
抗体は、体性 hypermutation (SHM)、クラス スイッチ組換え DNA (CSR) およびプラズマ細胞の分化を含むいくつかの重要な B 細胞の本質的なプロセスを通じて実行されます。近年、エピジェネティック修飾やヒストン脱アセチル化とマイクロ Rna (Mirna) などの要因が後成の要因の機能不全につながる発見されました、図形抗体を B 細胞遺伝的プログラムと対話する示されています。自己抗体の応答。エピジェネティックな変調器への応答における B 細胞におけるゲノム マイクロ Rna と mRNA 発現解析は、B 細胞の機能と抗体の応答のエピジェネティック制御を理解することにとって重要です。ここでは、CSR と形質細胞に分化する B 細胞を誘導、ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤 (定) とこれらの B セルを扱うマイクロ Rna と mRNA の発現解析のためのプロトコルを示す.このプロトコルで直接次世代 mRNA シーケンス (mRNA seq) と miRNA seq 技術、ゲノムおよび定量的逆転写 (qRT) 読み取り順序のマッピングを使用して相補的 DNA (cDNA) シーケンス分析-PCR。これらのアプローチで、CSR とプラズマ細胞分化を受ける B 細胞、HDI、エピジェネティックな調節選択的にマイクロ Rna と mRNA 発現を調節して CSR とプラズマ細胞分化を変更を定義しました。
Introduction
エピジェネティックなマークや、DNA のメチル化、ヒストン修飾、(マイクロ Rna を含む)、非コード Rna などの要因、遺伝子式1を変更することにより細胞機能を調節します。エピジェネティック修飾免疫グロブリン クラス スイッチ DNA 組換え (CSR)、体性 hypermutation (SHM)、メモリー B 細胞や形質細胞、抗体と自己抗体により変調への分化などの B リンパ球の機能を調節します。応答2,3。CSR SHM が高い T に依存し、T 独立した抗原4B 細胞に誘導される活性化誘導シチジン アデノシンデアミナーゼ (援助、 Aicdaとしてエンコード) が批判的に必要です。クラス スイッチ/hypermutated の B 細胞は 1 (Blimp1、 Prdm1としてエンコード)5大量の B リンパ球による成熟タンパク質に批判的に依存しての方法で抗体を分泌する形質細胞に分化します。B 細胞の異常なエピジェネティックな変化異常抗体/抗体応答は、アレルギー反応や自己免疫1,4につながる可能性があります。B 細胞の内因、Mirna などどの後成の要因を理解すると、調節遺伝子発現は、ワクチン開発のために重要ではないが、潜在的な異常抗体/抗体応答のメカニズムを明らかにすることも重要です。
ヒストンのアセチル化と脱アセチル化されてヒストンのアセチルトランスフェラーゼ (帽子) とヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 通常触媒を用いるヒストン蛋白質のリジン残基の変更。これらの変更をクロマチンの増加または減少のアクセシビリティにつながる、さらに許可または DNA と遺伝子発現5,6,の変質するトランスクリプション要因または蛋白質の結合を妨げる7,8. HDAC の抑制剤 (HDI)、hdacs をしたの機能を阻害する化合物のクラス。ここでは、B 細胞の本質的な遺伝子発現プロファイルとその機構上 HDAC の規制に対処するため HDI (バルプロ酸) を使用しました。
Mirna が小さく、非コード Rna 約 18 に 22 ヌクレオチド長でいくつかの段階を経て生成されます。miRNA 宿主遺伝子が書き換えられるとヘアピン プライマリ マイクロ Rna (Mirna-pri)。彼らは、pri Mirna が処理されてさらに Mirna 前駆体 (pre-Mirna) に細胞質にエクスポートされます。最後に、pre miRNAs の胸の谷間を経て成熟 Mirna が形成されます。miRNAs そのターゲット Mrna6、7の 3′ 非翻訳領域内の相補的なシーケンスを認識します。転写後サイレンシングは、miRNAs は、増殖・分化・ アポトーシスの10、11などの細胞の活動を調節します。複数 miRNAs 同じ mRNA をターゲットすることができますので、1 つの単一のマイクロ Rna が複数の Mrna を対象可能性のある個々 の値は、miRNAs の集合的な効果を理解するマイクロ Rna 発現プロファイルのコンテキストのビューを持つことが重要です。miRNAs B 細胞の発達と周辺分化段階特異 B 細胞の分化、抗体応答、自己免疫1,4,9に関与することが示されています。3′ UTR AicdaとPrdm1miRNAs8の対象にできるいくつか検証済みまたは予測の進化上保存されたサイトがあります。
エピジェネティックな変調では、ヒストンの転写後修飾および Mirna を含む遺伝子式9の細胞型と細胞の段階に特異的パターンを表示します。ここでは、我々 は miRNA と mRNA 発現、CSR およびプラズマ細胞の分化の HDI を介した変調を定義する方法を説明します。CSR と形質細胞分化を受ける B 細胞を誘導するためのプロトコルが含まれますHDI; と B 細胞を治療のためqRT PCR、seq、マイクロ Rna と mRNA seq10、11,12,8,13マイクロ Rna と mRNA 発現を分析するため。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、B 細胞クラス スイッチや形質細胞分化を誘導するために包括的なアプローチを提供します。エピジェネティックな変調、すなわち HDI; によってその影響を分析するにはこれらの細胞の mRNA および miRNA の表現に HDI の効果を検出します。これらのアプローチのほとんどは、ヒト B 細胞機能と mRNA/miRNA 発現の後成的要因の影響を分析する使用できます。定などのエピジェネテ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH 助成金 AI 105813 や AI 079705 (PC) に支えられた、(PC) にループス グラント ALR 295955 でループス研究ターゲット識別のための同盟および関節炎国立研究財団研究は (HZ) に付与します。TS は、xiangya の第 2 UT 医学サンアントニオ校の医学生の訪問プログラムのコンテキストで小児医療センター、第二 xiangya の第 3 病院、中央南大学、長沙、中国によって支えられました。
Materials
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific – Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
Riferimenti
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