子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ
Summary
この原稿は、単一細胞レベルおよび蛍光標識された神経細胞の興奮で、ニューロンの構造的接続性を記述するために子宮内エレクトロポレーション（IUE） で使用するプロトコルを提供します。組織学は、樹状突起および軸索突起を特徴付けるために使用されます。急性スライスにおける全細胞記録は、興奮性を調査するために使用されます。
Abstract
神経系は、異なる神経細胞の種類の巨大な範囲で構成されています。これらのニューロンの亜集団は、軸索の接続の他の特徴、それらの異なる樹枝状の形態、それらの特定のパターン、およびそれらの選択的な焼成反応の間、ことを特徴とします。開発中の分化のこれらの側面を担当する分子・細胞メカニズムはまだよく理解されていません。
ここでは、標識に結合されたプロトコルを記述し、皮質ニューロンの構造的な接続性と興奮性を特徴づけます。 子宮内エレクトロポレーション（IUE）プロトコルの変更は、ニューロンのまばらな人口の標識化を可能にします。これは、順番に、個々のニューロンの樹状突起と軸索の識別と追跡、正確な軸索突起の層状場所の特性評価、および形態計測分析を可能にします。 IUEはまた、興奮性の変化を調べるために使用することができ野生型（WT）またはエレクトロポレーションの脳の急性スライスからホールセル記録とそれを組み合わせることにより、遺伝的に改変された神経細胞。これら2つの技術が構造的および機能的接続性の及び開発中に神経細胞の多様性を制御する分子機構のカップリングのより良い理解に貢献しています。これらの発生プロセスは、軸索の配線、ニューロンの機能的多様性、および認知障害の生物学上重要な意味を持ちます。
Introduction
樹状突起と軸索構造の開発が大脳皮質を含め、神経系における回路調節の重要な側面です。これは、多様な神経細胞亜集団の選択的な配線の間に重要な役割を果たしています。最近の報告数は、接続に加えて、神経細胞の分子多様性は、焼成の非常に特異的な様式の買収により反射され、ことが示されています。しかし、開発中に明確なニューロンのサブタイプの興奮性と接続性を決定するメカニズムだけでなく、コーディネートの程度は、まだよく、2は 1を理解されています。
生体内 loss-がと機能獲得型に特異的な遺伝子および回路の開発における彼らの影響力の発現レベルとの間の関係の研究を可能に分析します。 子宮内エレクトロポレーションでは （IUE）が広く研究するために使用される技術であり、それらの接続の全体的なパターンを研究するための特定のニューロン集団における目的の遺伝子の機能と。しかし、生きたマウスでは皮質層における軸索と樹状突起の形態学的特性を決定するために、まばらニューロンを標識することが不可欠です。 IUEと組み合わせたCre組換えシステムは、識別された皮質の薄層の個々の細胞によって放出された突起を解決するために、十分に低い密度でニューロンのまばらな集団をマークするために使用することができます。この方法は、電気穿孔脳（ 図1）の合理的な数の分析の後に定量的データを得るために、皮質ニューロン当たりの十分な数のラベル。この原稿は、接続のような微細な分析のための方法を提示しています。また別の実験において、分析するために同様の戦略を提示し、緑色蛍光タンパク質（GFP）の電流 – クランプ記録を行うことにより、ニューロンの電気的特性は、急性皮質切片から細胞を-electroporated。これらのプロトコールは汎用性がありますし、WTおよびトランスジェニック動物のニューロンの、また機能の損失と利益がIUE中に追加のプラスミドによって導入された神経細胞の興奮性と接続性の研究にも適用することができます。
このプロトコルは、胎生日（E）15.5におけるマウスのエレクトロポレーションについて説明したが、この技術は、E9.5 3及び生後（P）2~4の間の任意の年齢で行うことができます。初期段階でのエレクトロポレーションは、ニューロンおよび視床の前駆体および皮質の深層、後段のエレクトロポレーションマークより表面層（ 例えば、E15.5 IUEターゲット層II-IIIニューロン）を標的ながら。要約すると、単一細胞形態学的分析と電気生理学とIUEの組み合わせは、神経系のニューロンの巨大な構造的および機能的多様性の根底にある分子メカニズムを解明するための有用なツールです。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、それらの接続とその興奮性を分析するために、C75BL / 6マウスの体性感覚皮質の神経細胞を標識する方法を詳細に説明しています。既存の方法に関しては、そのようなニューロンあたり軸索分岐の数、それらの正確な地形、およびそれらの解剖学的部位として、接続の識別側面を可視化します。電極の位置を変化させることにより、このような帯状皮質（電極と脳との間の?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、その優れた技術支援のためと編集のためのLAヴァイスにR.・グティエレスとA.モラレスに感謝しています。 CGBはスペインMINISTERIOデCiencia電子Innovación（MICINN）、FPI-BES-2012から056011によって資金を供給されています。この作品はM.ナバレテにBBVA財団とSAF2014-58598-JIN（MINECO）からの助成金によっておよびラモンAreces財団と助成金SAF2014-52119-Rおよび（MINECOから）BFU2014-55738-REDTへの助成金によって賄われていましたM.ニエト。
Materials
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 |
| Scalpel Handle #3 – 12cm | Fine Science Tools | 10003-12 |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 |
| Adson Forceps-Serrated – Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 |
| Hardened Fine Scissors – Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14,5cm | Teleflex | PO143281 |
| Thin curved tips – Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 |
| Mathieu Needle Holder – Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL |
| 9mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 |
| Sutures – Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 |
| Borosilicate glass capillaries (100mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | – |
| Needle 25G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 |
| OCT Compound | Sakura | 4583 |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 |
| Microscope for Fluorescent Imaging – MZ10F | Leica | – |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | – |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | – |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | – |
| Cryostat – CM 1950 | Leica | – |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | – |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 |
| Air Table | Newport | – |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | – |
Riferimenti
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