गर्भाशय में Electroporation Neuronal उप-जनसंख्या के excitability और एकल कोशिका कनेक्टिविटी अध्ययन के लिए दृष्टिकोण
Summary
यह पांडुलिपि प्रोटोकॉल है कि utero electroporation (IUE) में उपयोग एकल कोशिका के स्तर पर और fluorescently लेबल न्यूरॉन्स के excitability में न्यूरॉन्स की संरचनात्मक कनेक्टिविटी वर्णन करने के लिए प्रदान करता है। प्रोटोकॉल के वृक्ष के समान है और axonal अनुमानों को चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। तीव्र स्लाइस में पूरे सेल रिकॉर्डिंग excitability जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
Abstract
तंत्रिका तंत्र अलग neuronal प्रकार की एक विशाल रेंज से बना है। ये न्यूरोनल उप-जनसंख्या अन्य सुविधाओं, उनके अलग वृक्ष के समान morphologies, axonal कनेक्टिविटी की उनकी विशिष्ट पैटर्न, और उनके चयनात्मक फायरिंग की प्रतिक्रियाओं के बीच में, की विशेषता है। विकास के दौरान भेदभाव के इन पहलुओं के लिए जिम्मेदार आणविक और सेलुलर तंत्र अभी भी खराब समझ रहे हैं।
यहाँ, हम लेबलिंग के लिए संयुक्त प्रोटोकॉल का वर्णन है और संरचनात्मक कनेक्टिविटी और cortical न्यूरॉन्स के excitability निस्र्पक। में utero electroporation (IUE) प्रोटोकॉल का संशोधन न्यूरॉन्स की एक विरल आबादी की लेबलिंग की अनुमति देता है। यह, बारी में, पहचान और dendrites और व्यक्तिगत न्यूरॉन्स, axonal अनुमानों के लामिना स्थान की सटीक लक्षण, और morphometric विश्लेषण के axons की ट्रैकिंग सक्षम बनाता है। IUE भी की उत्तेजना में परिवर्तन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताजंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) या electroporated दिमाग की तीव्र स्लाइस से पूरे सेल रिकॉर्डिंग के साथ संयोजन के द्वारा आनुवंशिक रूप से संशोधित न्यूरॉन्स। इन दोनों तकनीकों संरचनात्मक और कार्यात्मक कनेक्टिविटी के युग्मन के एक बेहतर समझ के लिए और विकास के दौरान न्यूरोनल विविधता को नियंत्रित करने के आणविक तंत्र का योगदान करते हैं। ये विकास की प्रक्रिया axonal तारों, न्यूरॉन्स की कार्यात्मक विविधता, और संज्ञानात्मक विकारों के जीव विज्ञान पर महत्वपूर्ण प्रभाव है।
Introduction
वृक्ष के समान और axonal संरचनाओं के विकास सेरेब्रल कॉर्टेक्स में शामिल है, तंत्रिका तंत्र में सर्किट विनियमन का एक महत्वपूर्ण पहलू है। यह विविध न्यूरोनल उप-जनसंख्या के चुनिंदा तारों के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हाल ही में रिपोर्ट की एक संख्या है कि पता चला है, कनेक्टिविटी के अलावा, न्यूरॉन्स की आणविक विविधता गोलीबारी की अत्यधिक विशेष मोड के अधिग्रहण से परिलक्षित होता है। हालांकि, तंत्र के विकास के दौरान उत्तेजना और विशिष्ट न्यूरोनल उपप्रकार की कनेक्टिविटी का निर्धारण करने के साथ-साथ समन्वय के अपने डिग्री, अभी भी खराब 1, 2 समझ रहे हैं।
विवो नुकसान में और लाभ के समारोह के विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति के स्तर और सर्किट के विकास में उनके प्रभाव के बीच संबंधों के अध्ययन के लिए अनुमति देने का विश्लेषण करती है। Utero electroporation में (IUE) व्यापक रूप से अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है एक तकनीक हैविशिष्ट neuronal आबादी में ब्याज की एक जीन के समारोह और उनके कनेक्टिविटी के समग्र पैटर्न का अध्ययन करने के लिए। हालांकि, रहने वाले चूहों में एक्सोन और cortical परतों में dendrites के लक्षण निर्धारित करने के लिए, यह कम न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए आवश्यक है। एक Cre पुनर्संयोजन IUE के साथ संयुक्त प्रणाली के अनुमानों पहचान cortical laminas के व्यक्ति की कोशिकाओं द्वारा उत्सर्जित हल करने के लिए एक पर्याप्त रूप से कम घनत्व में न्यूरॉन्स की एक विरल आबादी चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विधि electroporated दिमाग (चित्रा 1) की उचित संख्या के विश्लेषण के बाद मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए कोर्टेक्स प्रति न्यूरॉन्स के लिए पर्याप्त संख्या में लेबल। यह पांडुलिपि कनेक्टिविटी की तरह ठीक विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। यह भी एक इसी तरह की रणनीति प्रस्तुत विश्लेषण करने के लिए अलग प्रयोगों में, हरे प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) पर वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग के प्रदर्शन से न्यूरॉन्स के बिजली के गुणों तीव्र cortical स्लाइस से कोशिकाओं -electroporated। ये समर्थकtocols न्यूरॉन्स में जो घाटा और समारोह की बढ़त IUE के दौरान अतिरिक्त plasmids से पेश कर रहे हैं की बहुमुखी हैं और excitability और गुम्मट और ट्रांसजेनिक जानवरों के न्यूरॉन्स की कनेक्टिविटी के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है, और भी।
हालांकि इस प्रोटोकॉल भ्रूण दिन (ई) 15.5 पर चूहों की electroporation का वर्णन है, इस तकनीक E9.5 3 और प्रसव के बाद दिन (पी) 2 से 4 के बीच किसी भी उम्र में किया जा सकता है। प्रारंभिक दौर में electroporation न्यूरॉन्स और चेतक के व्यापारियों और कोर्टेक्स की गहरी परतों, बाद में चरण electroporation के निशान अधिक ऊपरी परत (जैसे, E15.5 IUE लक्ष्यों परत द्वितीय-तृतीय न्यूरॉन्स) को निशाना बनाता है। सारांश में, एकल कोशिका रूपात्मक विश्लेषण और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी साथ IUE के संयोजन तंत्रिका तंत्र में न्यूरॉन्स की भारी संरचनात्मक और कार्यात्मक विविधता अंतर्निहित आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णन C75BL / 6 चूहों के somatosensory प्रांतस्था के न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए कैसे क्रम में उनकी कनेक्टिविटी और उनकी उत्तेजना का विश्लेषण करने के लिए। मौजूदा तरीकों के संबंध में, यह इस …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए और संपादन के लिए ला वेइस के लिए आर Gutiérrez और ए मोरालेस के आभारी हैं। CGB स्पेनिश Ministerio de Ciencia ई Innovación (MICINN), एफपीआई-bes-2012-056011 वित्त पोषित है। इस काम के एम Navarrete के लिए BBVA फाउंडेशन और SAF2014-58598-जिन (MINECO) से अनुदान द्वारा और रेमन Areces फाउंडेशन और अनुदान SAF2014-52119 आर और BFU2014-55738-REDT (MINECO से) करने से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया एम Nieto।
Materials
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 |
| Scalpel Handle #3 – 12cm | Fine Science Tools | 10003-12 |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 |
| Adson Forceps-Serrated – Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 |
| Hardened Fine Scissors – Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14,5cm | Teleflex | PO143281 |
| Thin curved tips – Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 |
| Mathieu Needle Holder – Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL |
| 9mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 |
| Sutures – Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 |
| Borosilicate glass capillaries (100mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | – |
| Needle 25G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 |
| OCT Compound | Sakura | 4583 |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 |
| Microscope for Fluorescent Imaging – MZ10F | Leica | – |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | – |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | – |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | – |
| Cryostat – CM 1950 | Leica | – |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | – |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 |
| Air Table | Newport | – |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | – |
Riferimenti
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