Genomvid Fastställande av däggdjur Replication Timing av DNA-innehåll Mätning
Summary
We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.
Abstract
Replikation av genomet inträffar under S-fasen av cellcykeln i en starkt reglerad process som garanterar trohet DNA duplicering. Varje genomregion replikeras på en viss tid under S-fasen genom samtidig aktivering av flera replikationsursprung. Tid för replikering (dir) korrelerar med många genomiska och epigenetiska funktioner och är kopplat till mutationshastigheter och cancer. Förstå hela iska syn på replikeringsprogrammet i hälsa och sjukdom är en stor framtida mål och utmaning.
Denna artikel beskriver i detalj "Kopiera Antal Förhållande S / G1 för att kartlägga genom Time of Replication" -metoden (här kallad: CNR-ToR), en enkel metod för att kartlägga genomet breda uppdrags av däggdjursceller. Metoden är baserad på kopietalet skillnaderna mellan S-fasceller och G1-fasceller. CNR-dir metoden utförs i 6 steg: 1. Framställning av celler och färgning med propidiumjodid (PI); 2. Sorting G1 och S-fas-celler med användning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS); 3. DNA-rening; 4. Sonikering; 5. Bibliotek förberedelse och sekvensering; och 6. Bioinformatisk analys. CNR-ToR metod är en snabb och enkel metod som resulterar i detaljerade replikering kartor.
Introduction
Däggdjurs-DNA-replikation är hårt reglerad för att säkerställa den exakta replikering av varje kromosom exakt en gång under cellcykeln. Replikering sker enligt en starkt reglerad ordning – flera stora genomiska regioner (~ Mb) replikera i början av S-fasen (början replikera domäner), medan andra genomiska regioner replikera senare vid mitten eller sent S-fas (mitten och slutet av replikerings domäner) 1. Det mesta av genomet replikeras samtidigt i alla vävnader (konstitutiva ToR domäner), medan 30% – 50% av genomet, ändrar sin dir mellan vävnader 2, under differentiering 3, 4 och i mindre utsträckning även under cancertransformation 5 . Dessutom är vissa genomiska regioner replikera asynkront 6, 7, 8, nämligen det finns en skillnadi uppdrags mellan de två alleler.
ToR korrelerar med många genomiska och epigenomiska funktioner, inklusive transkriptionsnivåer, GC-innehåll, kromatin tillstånd, genen densitet, etc. 1, 9. Tor är också förknippad med mutationshastigheter och typer 10, 11 och därför föga förvånande, är störningar av replikeringsprogram kopplat till cancer 12, 13. Orsakssambandet mellan reglerna och kromatinstrukturen är ännu inte klarlagd. Det är möjligt att öppna kromatin underlättar tidig replikation. Tyder emellertid på en alternativ modell som kromatinet monteras vid replikering och de olika kromatin regulatorer närvarande vid början och slutet av S-fasen leder till differentiell förpackning av tidiga och sena replikerande regionerna 1, 14 </sup>. Vi har nyligen visat att den uppdrags formar innehållet GC genom att påverka vilken typ av mutationer som förekommer i olika genomiska regioner 11.
Fluorescens in situ hybridisering (FISH) är den huvudsakliga metoden för att mäta ToR på individ loci. Den utförs helt enkelt genom att räkna den procentuella andelen S-fasceller som uppvisar enda fisk signaler kontra andelen dubbletter för en given allel 15, 16. En alternativ metod, består av puls märkning av DNA med BrdU, sortering celler enligt deras DNA-innehåll till flera tidpunkter längs S, immunoprecipitating DNA innehållande BrdU, och kontroll av överflöd av utfällt DNA med qPCR 17.
Genomisk dir kartläggning kan uppnås genom två metoder. Den första metoden är en genomisk version av BrdU-IP-baserad metod som beskrivits ovan, i vilken en kvantifiering av den mängdav utfällt DNA i varje fraktion sker samtidigt för hela genomet genom hybridisering till mikromatriser eller djup sekvensering. Den andra metoden, CNR-dir, är baserad på mätning av kopietalet av varje genomregion av S-fasceller och normalisering av DNA-halten i G1-celler. I denna metod, celler sorteras genom FACS till icke-replikerande (G1 fas) och replikera (S-fas) grupper (Figur 1). Celler i G1 har samma antal kopior i alla iska regioner och därmed deras DNA-innehåll bör vara densamma. Å andra sidan, det DNA kopietal i S beror på uppdrags, eftersom tidiga replikerande regioner genomgick replikation i de flesta celler och därför är deras DNA-innehåll fördubblas, medan sena replikerande regioner som inte har replikerats ännu i de flesta celler och därför är deras DNA-innehåll kommer vara liknande det i G1-celler. Därav S till G1 förhållandet mellan DNA-innehåll är ett tecken på reglerna. Mängden DNA för varje genomregion mäts antingen genom hybridisering tillmikromatriser eller genom djupsekvense 2, 8. Fördelarna med CNR-dir-metoden kommer att diskuteras vidare.
Detta dokument beskriver CNR-dir förfarande för genomisk dir kartläggning såsom beskrivs i figur 2. Papperet diskuterar de fina detaljerna i hela processen från att samla celler tills den grundläggande analys av resultaten och skapandet av genomiska kartor ToR. Protokollet som beskrivs i detta dokument har utförts med godkänt resultat på olika celltyper odlas i kultur. Framtida förbättringar av detta protokoll kan leda till kartläggningen av uppdrags in vivo och i sällsynta celltyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
CNR-dir kan utföras i princip vilken eukaryot prolifererande cellpopulation som kan delas genom FACS till S och G1-faserna (översikt av Rhind N. och Gilbert DM 20). Den metod som beskrivs här har justerats till däggdjursceller med en genomstorlek av ~ 3 Gb såsom människa och mus. Det behövs små förändringar i CNR-uppdrags protokoll (i förberedelse cell och sekvense djup), för att anpassa den till andra eukaryoter. Uppmärksamhet måste ägnas åt insamlingen av tillräckliga mängder …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Oriya Vardi för att få hjälp att generera siffror. Arbetet i IS-gruppen stöddes av Israel Science Foundation (bidrag nr 567/10) och Europeiska forskningsrådet Starting Grant (# 281.306).
Materials
| PBS | BI (Biological Industries) | 02-023-1A |
| Trypsin-EDTA | BI (Biological Industries) | 03-052-1B |
| 15ml conical tube | Corning | 430790 |
| 5ml Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap | BD-Falcon | 352235 |
| Ethanol | Gadot | 64-17-5 |
| RNAse-A 10mg/ml | Sigma | R4875 |
| Propidiom iodide 1mg/ml | Sigma | P4170 |
| parafilm | Parafilm | PM-996 |
| 1.5ml DNA LoBind Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431021 |
| BSA | Sigma | A7906 |
| 1.7ml MaxyClear tube | Axygen | MCT-175-C |
| magnetic beads – Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 |
| Ultrasonicator | Covaris | M-series -530092 |
| 50 µl microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6x16mm | Covaris | 520096 |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Invitrogen | Q32854 |
| Electrophoresis.2200 Tape station system | Agilent | D1000 ScreenTape |
| Seqeuncing – Illumina NextSeq system | Illumina | SY-415-1001 |
| Dneasy kit for DNA purification | Qiagen | 69504 |
| PureProteom Magnetic Stand | Millipore | LSKMAGS08 |
| Anti-BrdU/FITC | DAKO | F7210 |
| FACS sorter | BD | FACSARIA III |
| FACS software | BD | FACSDiva v 8.0.1 |
Riferimenti
- Farkash-Amar, S., Simon, I. Genome-wide analysis of the replication program in mammals. Chromosome Res. 18 (1), 115-125 (2010).
- Yaffe, E., et al. Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture. PLoS Genet. 6 (7), e1001011 (2010).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), (2008).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Farkash-Amar, S., et al. Global organization of replication time zones of the mouse genome. Genome Res. 18 (10), 1562-1570 (2008).
- Koren, A., McCarroll, S. A. Random replication of the inactive X chromosome. Genome Res. 24 (1), 64-69 (2014).
- Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genet. 10 (5), e1004319 (2014).
- McNairn, A. J., Gilbert, D. M. Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication. Bioessays. 25 (7), 647-656 (2003).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Kenigsberg, E., et al. The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content. Nucleic Acids Res. 44 (9), 4222-4232 (2016).
- Woo, Y. H., Li, W. H. DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes. Nat Commun. 3, 1004 (2012).
- Liu, L., De, S., Michor, F. DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes. Nat Commun. 4, 1502 (2013).
- Goren, A., Cedar, H. Replicating by the clock. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 25-32 (2003).
- Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. EMBO J. 11 (3), 1217-1225 (1992).
- Smith, L., Thayer, M. Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (70), e4400 (2012).
- Simon, I., et al. Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development. Nature. 401 (6756), 929-932 (1999).
- Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. Coating agents for cell recovery. Google Patents. , (1993).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
