Efficace isolamento di isole funzionali da neonatali mouse Pancreas

Chen Huang; Guoqiang Gu

doi:10.3791/55160

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Articolo metodologico

Efficace isolamento di isole funzionali da neonatali mouse Pancreas

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DOI:

10.3791/55160

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6 gennaio 2017

Chen Huang¹ , Guoqiang Gu¹

¹Department of Cell and Development Biology, Vanderbilt University Medical School

In questo articolo

Sommario

Descriviamo qui un protocollo per isolare isolotti intatti da topi neonati. Pancreas sono stati parzialmente digerito con collagenasi, seguita da lavaggio e raccolta manuale. 20 - 80 clusters insule possono essere ottenuti per pancreas da topi appena nati, che sono adatti per diversi studi insulari.

Abstract

protocolli isolotto-isolamento di perfusione a base di grandi dimensioni pancreas dei mammiferi sono ben stabiliti. Tali protocolli sono facilmente effettuate in molti laboratori causa delle grandi dimensioni del dotto pancreatico che permette iniettabile collagenasi pronta e successiva perfusione tissutale. Al contrario, isolamento delle isole dal pancreas piccolo, come quello dei topi neonatali, è impegnativo, perché la perfusione non è facilmente realizzabile nel piccolo pancreas. Qui si descrive una semplice procedura dettagliata che recupera un numero considerevole di isolotti da topi appena nati con assistenza visiva. Appena sezionato intero pancreas sono stati digeriti con 0,5 mg / ml di collagenasi IV disciolto in soluzione salina bilanciata Hanks '(HBSS) a 37 ° C, in tubi da microcentrifuga. I tubi sono stati sfruttato regolarmente per aiutare la dispersione dei tessuti. Quando la maggior parte del tessuto è stata dispersa per piccoli gruppi circa 1 mm lisati sono stati lavati tre a quattro volte con mezzo di coltura con siero fetale bovino 10% (FBS). cluster Islet,privo di tessuti acinar riconoscibili, possono poi essere recuperati sotto dissezione stereoscope. Questo metodo recupera 20 - 80 piccole e grandi dimensioni isolotti per pancreas di topo appena nato. Questi isolotti sono adatti per saggi a valle più immaginabili, tra cui la secrezione di insulina, l'espressione genica, e la cultura. Un esempio di saggio secrezione di insulina è presentato per convalidare il processo di isolamento. Il background genetico e il grado di digestione sono i maggiori fattori che determinano il rendimento. soluzione di collagenasi Appena fatto con alta attività è preferito, in quanto aiuta in isolamento endocrino-esocrina. La presenza di cationi [calcio (Ca ²⁺⁾ e magnesio (Mg ^2+)] in tutte le soluzioni e siero bovino fetale al lavaggio / sono necessari per una buona resa di isolotti con integrità supporto corretto prelievo. Un ambito dissezione con un buon contrasto e l'ingrandimento aiuterà anche.

Introduzione

L'isolamento delle isole pancreatiche pure è essenziale per il dosaggio della secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS) delle cellule beta e per il trapianto di isole da donatori cadaverici ^1-3. È inoltre necessario stabilire l'espressione genica endocrina nelle cellule insulari ^{4, 5}. A tal fine, sono stati stabiliti protocolli dettagliati per consentire l'isolamento delle isole pancreatiche da grandi pancreate (⁶ e riferimenti ivi contenuti). Questi metodi si basano sulla perfusione enzimatica per dissociare l'acinare dai tessuti insulari, insieme alla separazione in gradiente e al picking manuale. Pertanto, l'isolamento de....